支原體培養基質控菌株菌種代次與生長曲線研究

朱真，萬建青，楊挺英，康凱

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

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支原體培養基質控菌株菌種代次與生長曲線研究

朱真，萬建青*，楊挺英，康凱

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

為探究支原體液體培養基和固體培養基質控菌豬鼻支原體生長規律，以活菌濃度，菌液pH值為指標，比較了不同代次與不同傳代方式豬鼻支原體生長情況。結果顯示：3%與10%濃度傳代，0～48 h內，活菌濃度持續上升，菌液pH值持續下降，3%濃度傳代的支原體生長較均勻，更利于菌種生長；1～5代支原體活菌濃度無顯著差異；通過0.3 mL菌液加9.7 mL培養基傳代，20組菌液平均濃度為(24.4±5.7)×108CFU/mL，通過0.9 mL菌液加29.1 mL培養基傳代，菌液平均濃度為(7.2±2.1)×108CFU/mL，兩種濃度差異極顯著，前種傳代方式更有利于支原體生長。本次試驗為支原體液體和固體培養基的質控工作標準化提供參考。

豬鼻支原體；培養基質控；菌種代次；生長曲線

支原體污染是細胞培養過程中常見和棘手的污染源，培養法是支原體檢驗的常用方法[1-3]。國內已有通過生長滴度測定法，獲得牛支原體OF2株、山羊支原體山羊肺炎亞種分離株M1601在不同培養基中生長曲線的報道[4-5]，也有人通過活菌計數測定法獲得人型支原體(Mh)生長曲線[6]。測定不同時刻牛支原體的OD值和pH，亦可繪制該株牛支原體的生長曲線，但只能是在一定程度上反映生長趨勢，而無法進行計量描述，有一定局限性[7]。

豬鼻支原體(CVCC361)作為支原體液體培養基和支原體固體培養基的質控菌株[8]，其生長曲線于2012年被國內學者繪制完成，但就培養基質控菌株的標準化工作而言，其傳代次數、菌液接種適宜比例、生長滴度變化等還需進一步考證[9]。為彌補這一研究空缺，本試驗就豬鼻支原體菌液活菌濃度與pH值變化關系以及適宜傳代代次等進行了研究，旨在為支原體液體培養基和支原體固體培養基的質控工作的標準化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 豬鼻支原體(CVCC361)，由中國獸醫藥品監察所提供。

1.1.2 培養基 支原體液體培養基、支原體固體培養基，均由北京中海生物科技有限公司提供。

1.1.3 儀器 生物安全柜，NUAIR公司；CO2培養箱和37 ℃培養箱，SANYO公司；pH計，METTLER TOLEDO公司；渦旋震蕩器，北京金紫光科技發展有限公司；冰箱，海爾公司。

1.2 方法

1.2.1 不同接種濃度和收獲時間差異比較

1.2.1.1 菌液制備 將豬鼻支原體凍干菌株啟開，用支原體液體培養基恢復原體積，再以10%比例接種至支原體液體培養基中，37 ℃培養24 h后，分別按3%(將0.9 mL菌液加至29.1 mL支原體液體培養基中)和10%(將3 mL菌液加至27 mL支原體液體培養基中)兩種比例進行連續傳代，選擇3代菌作為工作菌液。

1.2.1.2 活菌計數及pH值測定 以傳代后放入培養箱培養的時刻作為該代次菌株生命的零點，分別選擇3%濃度接種菌液的0、16、24、40、48 h以及10%濃度接種菌液的0、6、24、30、48 h這幾個時間點，吸取菌液0.2 mL至1.8 mL支原體液體培養基中，以這種方式，10倍系列稀釋至10-6，選擇該稀釋度菌液，吸取0.1 mL滴至支原體固體培養基平皿表面，進行活菌計數，同時對相應時間點的菌液進行pH值測定，每種比例分別選取3個樣本。

1.2.1.3 生長曲線的繪制 取各時間點的活菌計數結果的平均值，以時間為橫軸，分別以活菌濃度和pH值變化值為縱軸，繪制3%和10%傳代比例下的豬鼻支原體生長曲線和pH值變化曲線。

1.2.2 不同菌種代次差異比較

1.2.2.1 菌液制備 將豬鼻支原體凍干菌株啟開，用支原體液體培養基恢復原體積，10%比例接種至支原體液體培養基中，37 ℃培養24 h后，再按3%比例，將0.3 mL菌液加至9.7 mL支原體液體培養基中，以這種方式，連續傳至5代，分別選擇1～5代菌作為工作菌液。

1.2.2.2 活菌計數分別選擇1～5代菌菌液，各代次選取4個樣本，用“1.2.1.2”中所提及的方法，進行活菌計數，并根據各處理重復數相等的方差分析方法[10]，對各代次間活菌濃度進行差異分析。

1.2.3 不同傳代體積差異比較 將豬鼻支原體凍干菌株啟開，用1 mL支原體液體培養基恢復原體積，10%比例接種至支原體液體培養基中，37 ℃培養24 h后，再按3%比例，分別選擇兩種不同培養體積傳代，一種方式是將0.3 mL菌液加至9.7 mL支原體液體培養基中，另一種則是0.9 mL菌液加至29.1 mL培養基，37 ℃培養24 h后，再以各自的方式傳至下一代，直至5代，隨機選擇兩種方式傳代的2～5代菌各20個樣本，用“1.2.1.2”中所提及的方法進行活菌計數，并用t檢驗(雙樣本異方差檢驗)進行比較。

2 結果

2.1 不同接種濃度和收獲時間差異比較

2.1.1 不同接種濃度 活菌濃度和pH值的比較兩種濃度接種的豬鼻支原體各時間點的活菌濃度和pH值如表1和表2所示。從表1可以看出，3%濃度接種的豬鼻支原體0～48 h活菌濃度持續上升，到48 h達到峰值13.1×108CFU/mL，菌液pH值則持續下降，在40～48 h之間某時刻降至7.0以下。從表2可以看出，10%濃度接種的豬鼻支原體0～48 h活菌濃度持續上升，到48 h達到峰值14.0×108CFU/mL，菌液pH值則持續下降，在30～48 h之間某時刻降至7.0以下。

表1 3%濃度接種豬鼻支原體各時刻生長情況

表2 10%濃度接種豬鼻支原體各時刻生長情況

2.1.2 生長曲線 兩種接種濃度豬鼻支原體生長曲線見圖1和圖2。從圖1可以看出，以3%濃度接種，豬鼻支原體在0～48 h活菌濃度平穩上升，生長速率逐漸升高。以10%濃度接種，豬鼻支原體在0～48 h活菌濃度持續上升，0～6 h為遲緩期，6～48 h為對數期，其中24～30 h生長速率最快。從圖2可以看出，0～48 h內，兩種濃度接種菌液pH值變化范圍和趨勢大致相同，變化范圍為6.63～7.55。3%濃度接種，0～16 h內，pH值下降平緩，16～48 h pH值下降速度較快。10%濃度接種，0～6 h內，pH值下降平緩，6～48 h pH值下降速度較快，且10%比3% pH值下降更快。

圖1 不同接種比例豬鼻支原體生長曲線

圖2 不同接種比例豬鼻支原體pH值變化

2.2 1～5代菌活菌計數結果 活菌計數結果見表3。各代次間活菌濃度進行差異分析結果見表4，F=1.67

表3 1～5代菌活菌計數結果

表4 1～5代菌活菌計數方差分析表

2.3 不同傳代體積差異比較 從表5可以看出兩種傳代體積豬鼻支原體不同生長情況，“0.3 mL菌液加入9.7 mL培養基”這種體積構成的傳代方式下，20組菌液濃度平均值為24.4×108CFU/mL，標準差5.7；“0.9 mL菌液加入29.1 mL培養基”這種體積構成的傳代方式下，20組菌液濃度平均值為7.2×108CFU/mL，標準差2.1；用雙樣本異方差假設下t檢驗對這兩組實驗數據進行分析，兩種傳代方式下活菌濃度之間差異極顯著。

表5 不同傳代體積豬鼻支原體活菌濃度

**表示差異極顯著

3 討論與小結

本試驗通過活菌計數和pH值測定，首次確定了豬鼻支原體適宜傳代比例、收獲時間、菌種代次以及傳代體積。

3.1 傳代比例 傳代比例是微生物傳代過程中一項重要的技術參數，劉軼秋等曾將3%作為支原體液體培養基質控菌豬鼻支原體的傳代比例[9]，而在日常檢驗中，常用的比例是10%，通過比較，10%接種傳代的菌，前期生長較快，而3%接種傳代的菌后期生長較快，兩種濃度傳代的菌濃度最后趨于統一。以3%比例傳代，豬鼻支原體初始數量相對較少，培養基體積相對較多，單位數量豬鼻支原體獲得的營養也更加豐富，更利于生長。另外，豬鼻支原體在培養基中代謝產生的酸性物質使pH值下降，而支原體這類微生物對生長環境的酸堿度有嚴格要求，pH值低于7的環境則會造成其生長抑制或死亡[2]，有報道發現，在液體培養基中，pH改變和肺炎支原體生長有密切關聯，pH接近6時達到最大菌濃度，pH降至5.2時肺炎支原體迅速死亡[11]。在3%比例傳代下，菌液pH值下降相對較慢，以這種比例傳代，對豬鼻支原體的生長亦是一種保護，通過上述分析，較之10%，3%更適于作為培養基日常檢驗中的傳代比例。

3.2 菌種最佳收獲時間 結合豬鼻支原體的生長曲線和pH值變化來看，豬鼻支原體傳代后16～48 h內活菌濃度達(4.6～13.1)×108CFU/mL，在這個時間段內收獲菌液均可，但考慮到豬鼻支原體對低pH值的敏感性，故應根據每次傳代接種情況的不同，在保證菌種充分生長的前提下，在菌液明顯變黃(pH<7)前收獲。

3.3 菌種代次 按照《中國獸藥典》二〇一〇年版規定支原體液體培養基質控菌豬鼻支原體傳代不可超過5代[8]，故本次實驗只對照1～5代菌。通過比較各代次菌在相同溫度下，培養相同時間后的活菌濃度，判斷出各代次菌之間生長差異。通過統計學方法分析，1～5代菌活菌濃度之間無顯著差異，在培養基檢驗工作中，為使培養基質控菌均一、穩定、活性強，可將1～5代菌作為質控菌工作菌液。

3.4 傳代體積 豬鼻支原體兼性厭氧，且一般需要5%～10%CO2生長環境[2]，在封閉的細胞培養瓶中，培養基和菌液混合體體積較小，氧氣二氧化碳等氣體體積相對較大，小體積培養相對于大體積培養，優勢在于氣體更多。從本次試驗結果來看，同為3%傳代比例下，“0.3 mL菌液+9.7 mL培養基”這種小體積的傳代方式比“0.9 mL菌液+29.1 mL培養基”這種大體積的傳代方式更利于豬鼻支原體生長，前者收獲時菌液濃度約為后者菌液濃度3倍，差異極顯著，說明在相對封閉的空間中，小體積培養模式更利于豬鼻支原體生長。通過上述分析可知，較之于“0.9 mL 菌液+29.1 mL 培養基”，將0.3 mL菌液加入9.7 mL培養基這種傳代方式更利于豬鼻支原體生長。

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(編 輯：李文平)

Study on the Generation and Growth Curve ofMycoplasmaCulture Medium Quality Control Strains

ZHU Zhen，WAN Jian-qing*，YANG Ting-ying，KANG Kai

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl，Beijing100081，China)

To research the growth characteristic ofMycoplasmahyorhinis，theMycoplasmaliquid and solid medium quality control strain, its growth conditions were compared under different generations and inoculation proportion with the index of pH and living cell concentration in the study. The results are followed: comparing passage concentration 3% and 10%,Mycoplasmastrains grew increasing and pH value continued to decline under two different concentration，but passage concentration 3% was more conducive toMycoplasmahyorhinisgrowth steady. There was no significant difference in the living strains concentration between 1～5 generations ofMycoplasma. By mixing 0.3 mL bacteria suspension and 9.7 mL medium, average bacteria concentration of 20 groups was (24.4±5.7)×108CFU/mL, by mixing 0.9 mL bacteria suspension and 29.1 mL medium, while the average value was (7.2±2.1)×108CFU/mL, two kinds of concentrations had a very significant difference and the former was more conductive to theMycoplasmagrowth. The text provided theory basis for the medium standardization work.

Mycoplasmahyorhinis；medium quality control；strains generation；growth curve

朱真，從事原材料質控的檢測工作。

萬建青。 E-mail: wanjianqing@ivdc.org.cn

2015-03-29

A

1002-1280 (2015) 08-0010-05

R375