海南產紅樹植物老鼠簕中2—苯并唑啉酮分離鑒定及含量測定

張宏武等

[摘要] 目的 分離制備海南產紅樹植物老鼠簕中指標性成分并建立其含量測定方法。 方法 選擇老鼠簕高效液相色譜-二極管陣列檢測器（HPLC-DAD）色譜中的主要成分作為其指標性成分進行分離鑒定，并應用HPLC建立其含量測定方法，色譜條件為：Shiseido（Pak-C18）色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），流動相：乙腈-水（35∶65）。流速1.0 mL/min；檢測波長：270 nm，柱溫：30℃。結果 從老鼠簕中分離鑒定了1個生物堿成分2-苯并唑啉酮，并建立了HPLC含量測定方法，在0.004 32～1.08 mg/mL范圍內呈良好的線性關系（r = 0.9999，n = 5）。平均回收率（n = 9）為97.54%。結論 本方法準確、簡便，重復性好，可用于海南產老鼠簕藥材中2-苯并唑啉酮的含量測定。

[關鍵詞] 老鼠簕；生物堿；高效液相色譜法

[中圖分類號] R284 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）02（b）-0106-04

[Abstract] Objective To reporte the isolation of 2-Benzoxzololinone alkaloid from the roots of Acanthus ilicifolius L. and establish a HPLC method to determine the content of the 2-Benzoxzololinone alkaloid in the root of Mangrove Acanthus ilicifolius L. from Hainan Province. Methods A Shiseido （Pak-C18） （5 μm， 4.6 mm×150 mm） column was used with a mobile phase of acetonitrile-water （35∶65）. The flow rate was 1.0 mL/min and the column temperature was setted at 30℃. The detection wavelength was 270 nm. Results The linear range of 2-Benzoxzolol was 0.004 32～1.08 mg/mL （r = 0.9999， n = 5） and the average recovery （n = 9） was 97.54%. Conclusion The method is accurate， simple， reproducible， and can be used to determine the content of 2-Benzoxzololinone alkaloid in Acanthus ilicifolius L. from Hainan Province.

[Key words] Acanthus ilicifolius L.； Alkaloid； HPLC

紅樹植物（Mangrove plants）是熱帶、亞熱帶海區潮間帶特有的木本植物，我國利用紅樹植物作為藥用已有較長的歷史，尤其是民間用藥。老鼠簕（Acanthus ilicifolius L.）為爵床科老鼠簕屬植物，又名老鼠怕、軟骨牡丹、蚧瓜等，其性寒，味淡，全株或根入藥，為紅樹林重要的藥用植物之一，與其他紅樹林植物共生于海灘及淺海中。全世界共有50種，其中屬于紅樹林的老鼠簕、小花老鼠簕（A. ebracteatus Vahl）和廈門老鼠簕（A. xianmensis Zhang）主要分布在我國廣西、廣東、海南、臺灣、福建和浙江南部沿海海岸[1]。民間廣泛用于治療急慢性肝炎、哮喘、風濕病、麻痹癥、蛇傷等，有鎮痛和抗感染作用。在海南民間常用老鼠簕消腫、解毒、治療淋巴結腫大、急性肝脾疼痛、黃疸、胃痛和哮喘，將其根搗碎水煮，加上蜂蜜口服，是治療乙型肝炎的特效藥[2]。現代藥理研究發現，其具有抗肝纖維化[3]和抗氧化[4-5]、抗腫瘤[6]、抗菌[7]、抗感染鎮痛[8]、預防骨質疏松[9]等作用。化學成分研究表明老鼠簕主要含有生物堿、黃酮類、皂苷、甾醇類化學成分[10-14]，其中生物堿類成分是其抗感染、止痛活性的主要物質基礎。有研究表明：老鼠簕中的2-苯并唑啉酮具有殺利什曼原蟲的作用[15]。目前尚未見對海南產老鼠簕植物質量控制的報道，為了開發利用海南的紅樹植物資源，筆者首次對海南產紅樹植物老鼠簕藥材的質量做了進一步的評價，對老鼠簕中的指標性成分——2-苯并唑啉酮，進行了分離制備和結構測定，并首次對其海南產8批老鼠簕藥材中2-苯并唑啉酮含量進行了測定。該方法可靠、靈敏、重復性好，可以很好地控制藥材的質量，為海南產老鼠簕藥材的質量標準的制訂提供了參考依據。

1 儀器與試藥

儀器Fisher-Johns熔點儀（溫度未校正）；BrukerAM600核磁共振波譜儀（TMS做內標）；996-2487高效液相色譜儀（美國Waters公司）：600泵；PDA紫外可見檢測器；empower工作站，電子天平（MSA125P-100-DU，賽多利斯，德國）；超聲波清洗器（KQ-500E，昆山市超聲儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）。柱色譜Sephadex LH-20為Pharmacia公司產品，薄層色譜及柱色譜用硅膠均為青島海洋化工廠產品。

試劑：色譜乙腈（Burdick & Jackon，美國）；娃哈哈純凈水；其余試劑均為北京化學試劑公司產分析純試劑。

樣品：8批海南產老鼠簕樣品分別于2008、2009年采自海南文昌、瓊山地區，由中國醫學科學院海南分所助理研究員李榕濤鑒定為爵床科老鼠簕屬植物Acanthus ilicifolius L.的根。

2 方法與結果

2.1 提取與分離

取老鼠簕藥材1 kg，粉碎機粉碎，過40目篩，用95%乙醇回流提取2次，每次2 h，提取液減壓回收溶劑至無醇味，得浸膏115 g，將115 g浸膏加適量水混懸后，用8倍量乙酸乙酯萃取3次。合并萃取液，并減壓濃縮，得到乙酸乙酯部分5 g。將乙酸乙酯部分反復經硅膠（100～200目）柱色譜分離，用二氯甲烷-甲醇（100∶0～0∶100）系統梯度洗脫，并經Sephadex LH-20凝膠柱分離，用二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脫，得到化合物32.8 mg，經NMR鑒定為2-苯并唑啉酮。

2.2 2-苯并口惡唑啉酮對照品核磁數據

3 討論

3.1 對照品的選擇

有研究表明，2-苯并唑啉酮對中樞神經系統有抑制作用，并有鎮靜、降溫、抗驚厥、催眠，肌松弛及抗真菌作用，其對利什曼原蟲的LD50為40 μg/mL[15]。是老鼠簕藥材中指標性成分，因此2-苯并唑啉酮的含量可以來評價老鼠簕藥材質量。

3.2 提取方法的選擇

本實驗曾分別用二氯甲烷、95%乙醇和甲醇作為提取溶劑，超聲提取老鼠簕中2-苯并唑啉酮：提取2次，每次20 min，合并濾液，純甲醇定容于5 mL量瓶中，高效液相色譜（HPLC）測定結果發現甲醇提取物中2-苯并唑啉酮最高。在確定提取溶劑后，又對甲醇超聲提取和回流提取方式及提取次數進行了考察，結果表明：甲醇超聲提取和回流提取對老鼠簕中2-苯并唑啉酮的含量影響不大，考慮到超聲提取方法簡便，易行，故選擇超聲提取方法，作為提取方法。對提取時間的考察：分別提取10、20、45、60 min，10 min不能完全提取，20 min和45 min結果基本相同，而60 min的結果比45 min略低，故選擇提取20 min。所以最后確定提取方法為：甲醇超聲提取2次，每次20 min。

3.3流動相的篩選

本試驗對甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-水這三種流動相系統進行了篩選比較，結果發現甲醇-水系統和甲醇-0.1%甲酸水系統存在色譜峰拖尾的現象，而換用乙腈-水系統即可得到滿意的色譜峰形，同時與其他雜質峰的分離度也很高。故選擇乙腈-水系統作為流動相，并調節流動相，最終選擇乙腈-水（35∶65）作為洗脫溶劑，老鼠簕藥材中2-苯并唑啉酮與其他組分得到較好的分離，且峰形對稱，出峰時間適宜，適合作為老鼠簕藥材中2-苯并唑啉酮含量測定用流動相。

3.4耐用性的考察

本實驗換用Agilent（SB-C18）色譜柱（5 μm，4.6 mm× 250 mm），用適當乙腈和水等度洗脫，2-苯并唑啉酮也達到基線分離，結果表明該方法耐用性較好。

3.5 柱溫和檢測波長的選擇

本實驗采用30℃柱溫，可以減少流動相黏度、降低柱壓并改善分離效果，同時降低環境對分離的影響程度，故將柱溫定為30℃。用二極管陣列檢測器在波長190～400 nm范圍內進行全波長掃描，通過觀察2-苯并唑啉酮的紫外圖譜，發現2-苯并唑啉酮在270 nm左右處有最大吸收，并且在270 nm處測定基線波動小，峰形理想，樣品中其他組分干擾小，所以選擇270 nm作為HPLC的檢測波長。

本方法直接進樣，不需要進行前處理，雜質峰與樣品峰能達到基線分離，且在該色譜條件下2-苯并唑啉酮對照品峰形均勻對稱，證明本方法簡便、準確、快速，重復性好，且該方法的重現性、穩定性、精密度、回收率試驗均均能滿足定量的要求，且專屬性好，故可以用于海南產紅樹植物老鼠簕中2-苯并唑啉酮的含量測定。

3.6 樣品測定結果

從海南不同產地的8批老鼠簕藥材中2-苯并唑啉酮含量測定的結果來看，8批老鼠簕藥材中2-苯并 唑啉酮含量差異比較大，因此有必要對老鼠簕藥材的采集、種植做進一步的系統研究及規范，從而保證老鼠簕藥材質量的穩定性。

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（收稿日期：2014-10-31 本文編輯：衛 軻）