黃連解毒湯對(duì)APP/ PS1雙轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病模型小鼠腦內(nèi)β-淀粉樣前體蛋白基因表達(dá)影響研究

馮 佩

(湖北省第三人民醫(yī)院，湖北 武漢 430032)

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黃連解毒湯對(duì)APP/ PS1雙轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病模型小鼠腦內(nèi)β-淀粉樣前體蛋白基因表達(dá)影響研究

目的：探討黃連解毒湯對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因阿爾茨海黙病模型小鼠腦內(nèi)β-淀粉樣前體蛋白(β-APP)基因表達(dá)的影響。方法：選用3月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病模型小鼠，隨機(jī)分為空白對(duì)照組(CMC組)、西藥安理申對(duì)照組(陽性對(duì)照組)、黃連解毒湯大劑量組(大HLJDT組)、黃連解毒湯中劑量組(中HLJDT組)、黃連解毒湯小劑量組(小HLJDT組)，連續(xù)灌胃給藥6個(gè)月后，通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)觀察各組APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病模型小鼠腦內(nèi)β-APP基因表達(dá)情況。結(jié)果：CMC組小鼠β-APPmRNA表達(dá)量較西藥安理申組明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，黃連解毒湯各劑量組小鼠β-APPmRNA表達(dá)量較CMC組明顯降低(P<0.05)，其中中劑量組小鼠β-APPmRNA表達(dá)量與西藥安理申組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論：各劑量黃連解毒湯均能降低APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病模型小鼠腦內(nèi)β-淀粉樣前體蛋白(β-APP)基因表達(dá)，其中中劑量組降低效果明顯優(yōu)于西藥安理申。

黃連解毒湯；APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病小鼠模型；β-淀粉樣前體蛋白；基因表達(dá)

隨著人類壽命的延長，阿爾茨海默病(Alzheimer's d isease，AD)的發(fā)病率急劇上升，已成為威脅人類健康和社會(huì)人口素質(zhì)的重大疾病[1]。據(jù)2001年Delphi調(diào)查結(jié)果[2]顯示，全球AD患者人數(shù)為2 430萬人，并以每年460萬人發(fā)病的速度遞增(平均每7s新增1例患者)，我國的AD發(fā)病率已經(jīng)達(dá)到4.8%[3]。很多國內(nèi)外學(xué)者都致力于AD發(fā)病機(jī)制及治療方法的研究?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，β-淀粉樣前體蛋白(APP)與AD的發(fā)生有密切關(guān)系。APP是一種由定位于21號(hào)染色體長臂上基因編碼的含有695～770個(gè)氨基酸殘基的跨膜蛋白。人APP基因含有19個(gè)外顯子(exons1-13，13a，14-18)，AD患者腦內(nèi)老年斑的主要成分為由APP基因的第16～17個(gè)外顯子編碼的APP水解片段Aβ肽[4]。因此，如果β-APP基因表達(dá)受到抑制，便能有效防止AD發(fā)生。本研究探討黃連解毒湯對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病模型小鼠腦內(nèi)β-淀粉樣前體蛋白(β-APP)基因表達(dá)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與動(dòng)物

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

3月齡SPF級(jí)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠50只[5]，體重(30±5)g，由南京大學(xué)動(dòng)物模式所提供(合格證號(hào)：2005674)，飼養(yǎng)于SPF屏障實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)室。

1.2 藥物

黃連解毒湯(HLJDT)由黃連、黃芩、黃柏和梔子組成，由湖北省第三人民醫(yī)院中藥房提供。鹽酸多奈哌齊(商品名：安理申)由湖北省第三人民醫(yī)院提供，衛(wèi)材中國藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，5mg/片，批號(hào)：H20050978。HLJDT與安理申使用前均用0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC)混懸。

1.3 材料

滅菌槍頭、勻漿器、EP管、去離子水、Trizol Reagent、三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO，日本)、Mr23i臺(tái)式低溫高速離心機(jī)(德國HERAUS)、Real-time PCR Detection System(SLAN,HONGSHI)。

2 方法

2.1 樣品溶液制備

按處方配伍的生藥粉碎后用水進(jìn)行提取，過濾提取液，濾液靜置，高速離心得到沉淀(Ⅰ)；濾液上大孔吸附樹脂，稀醇洗脫部分真空濃縮干燥，得到固體(Ⅱ)。將Ⅰ與Ⅱ均勻混合，得到有效部位，總得率為7.6%。所得有效部位化學(xué)成分主要為生物堿、黃酮、環(huán)稀醚萜。采用分光光度法分別測定生物堿類、黃酮類、環(huán)稀醚萜類成分含量，采用HPLC法測定指標(biāo)性成分小檗堿、黃芩苷、梔子苷的含量。有效部位(群)總含量高于55%，指標(biāo)性成分(群)總含量高于25%。

2.2 動(dòng)物分組及給藥方法

3月齡SPF級(jí)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠60只，體重(30±5)g，隨機(jī)分為空白對(duì)照組(CMC組)、西藥安理申對(duì)照組(陽性對(duì)照組)、黃連解毒湯大劑量組(大HLJDT組)、黃連解毒湯中劑量組(中HLJDT組)、黃連解毒湯小劑量組(小HLJDT組)5組，每組12只。具體處理如下：①CMC組：正常飼喂1周后，采用0.5%CMC灌胃；②安理申組：正常飼喂1周后，采用安理申混懸液灌胃(3mg/kg·d)；③大HLJDT組：正常飼喂1周后，每只小鼠給予HLJDT 865mg/kg·d；④中HLJDT組：正常飼喂1周后，每只小鼠給予HLJDT 433mg/kg·d；⑤小HLJDT組：正常飼喂1周后，每只小鼠給予HLJDT 216mg/kg·d。每組小鼠均連續(xù)灌胃給藥6個(gè)月。

2.3 AD小鼠腦組織RNA提取

末次灌胃1h后斷頸處死小鼠，快速取出腦組織，約50mg，放入研磨器，參照Trizol試劑(貨號(hào)：15596-026)說明書方法研磨20～30min，直至看不到大塊組織。將液體倒入滅菌后的EP管內(nèi)，加三氯甲烷250μL，充分混勻，靜置5min，4℃，13 000×g離心10min；取上清液置于另一滅菌EP管內(nèi)，加入等量異丙醇，混勻后放入4℃冰箱，15min后取出，4℃，13 000×g離心10min。倒出上層液體，留在管底的白色沉淀即為RNA。加入75%乙醇1mL，4℃，7 500×g離心5min，倒出上層液體，剩余白色沉淀，再瞬時(shí)離心，盡量吸干管內(nèi)液體，晾干，再加入適量去離子水溶解即得。

2.4 引物

內(nèi)標(biāo)基因上游引物：M-actin-S5’-CCGTGAAAAGATGACCCAG-3’；下游引物:M-actin-A5’-TAGCCACGCTCGGTCAGG-3’；目的基因上游引物：M-App-S5’-TGGCGGTGAAGACAAAGTAGTAG-3’；下游引物：M-APP-A5’-CTCAGTGGTGGTTGTGGTGG-3’。

2.5 RT-PCR

采用SYBR Green mix(TOYOBO公司，日本)試劑盒。RNA經(jīng)過提取、變性后，配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液：RNA 1μL，5×RT Buffer 4μL，dNTP 2μL，Oliga(dT)20 1μL，RNase free H2O 10μL，Rnase inhibitor 1μL，ReverTra Ace 1μL；42℃下反應(yīng)20min，95℃下反應(yīng)5min，4℃下反應(yīng)5min。按照下列組成配制PCR反應(yīng)液：SYBR Green mix 12.5μL，引物(5pmol/μL)2μL，ddH2O 8μL，cDNA(10倍稀釋)2.5μL；按以下條件完成PCR反應(yīng)，50℃、95℃下分別反應(yīng)2min后，95℃下變性15s，退火15s，72℃延伸45s，完成40個(gè)循環(huán)后，72℃下放置10min。在循環(huán)過程中，通過Real-time PCR Detection System(SLAN,HONGSHI)分析同時(shí)進(jìn)行熒光檢測，以β-actin為內(nèi)參照，按公式β-APP/β-actin計(jì)算β-APPmRNA水平。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

CMC組小鼠β-APPmRNA表達(dá)量較西藥安理申組明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，黃連解毒湯各劑量組小鼠β-APPmRNA表達(dá)量較CMC對(duì)照組明顯降低(P<0.05)，其中中劑量組小鼠β-APPmRNA表達(dá)量與西藥安理申組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 黃連解毒湯對(duì)癡呆小鼠β-APP基因轉(zhuǎn)錄的影響

組別樣本數(shù)(n)β-APP/β-actinCMC對(duì)照組101.2830±0.0622安理申對(duì)照組101.2800±0.0309*黃連解毒湯大劑量組101.2650±0.0280*黃連解毒湯中劑量組101.2080±0.1264*△黃連解毒湯小劑量組101.2920±0.0200*

注：與CMC對(duì)照組比較，*P<0.05,△P<0.01。

4 討論

AD是一種起病隱襲、呈進(jìn)行性發(fā)展的癡呆性疾病，是老年人最常見的神經(jīng)退行性疾病，其腦部主要病理學(xué)特征為老年斑(senile plaque，SP)、神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibral，NFT)、神經(jīng)元丟失等[6-7]。目前研究普遍認(rèn)為β-淀粉樣蛋白(Aβ)是SP的主要成分，其具有神經(jīng)毒性作用，大量Aβ聚集或沉積可形成老年斑[8]。而β-淀粉樣前體蛋白(β-APP)基因已被證實(shí)為AD的遺傳易感基因[9]。將APP突變基因轉(zhuǎn)移到動(dòng)物體內(nèi)，可使轉(zhuǎn)基因動(dòng)物大腦出現(xiàn)類似AD患者的病理學(xué)改變，但目前國內(nèi)APP突變轉(zhuǎn)基因模型產(chǎn)生老年斑的時(shí)間較晚[10]，或者不出現(xiàn)明顯的病理學(xué)及行為學(xué)改變[11]，影響了實(shí)驗(yàn)研究的可行性。70%～80%早發(fā)家族性AD是由PS1基因突變所致[12-13]，故此次實(shí)驗(yàn)選取APPswe轉(zhuǎn)基因小鼠與PS轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，建立APPswe/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型。有數(shù)據(jù)顯示此模型最早可在小鼠4、5月齡時(shí)出現(xiàn)老年斑[5]，筆者在小鼠6月齡時(shí)每組隨機(jī)抽取兩只進(jìn)行檢測，未發(fā)現(xiàn)明顯老年斑。

黃連解毒湯出自唐代王燾的《外臺(tái)秘要》，其由黃連、黃芩、黃柏、梔子四味苦寒藥物組成，是清熱解毒的經(jīng)典方劑。有研究表明AD患者腦內(nèi)Aβ沉積、老年斑形成及其周圍局灶性炎癥反應(yīng)使得Aβ和炎性細(xì)胞因子形成毒性環(huán)路，不斷損傷神經(jīng)細(xì)胞，最終導(dǎo)致神經(jīng)退行性病變[14-15]。該病理過程中產(chǎn)生的Aβ具有神經(jīng)毒性作用，屬于中醫(yī)“毒”的范疇，其中醫(yī)病理機(jī)制為“毒損腦絡(luò)”，而Aβ即是“毒損腦絡(luò)”機(jī)制中的啟動(dòng)環(huán)節(jié)。

本研究結(jié)果表明，黃連解毒湯各劑量組小鼠β-APPmRNA表達(dá)量較CMC對(duì)照組明顯降低(P<0.05)，其中中劑量組小鼠β-APPmRNA表達(dá)量與西藥安理申組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。提示黃連解毒湯能有效干預(yù)β-APP基因表達(dá)，阻止Aβ沉積形成老年斑，減輕神經(jīng)毒性作用，療效優(yōu)于西藥安理申，對(duì)阿爾茨海默病具有較好的預(yù)防及治療作用。

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(責(zé)任編輯：尹晨茹)

Experimental Study of the Effect of Huanglianjiedutang on Gene Expression of β-Amyloid Precuser Protein for APP/PS1 double transgenic mice Alzheimer’s disease mouse model

Feng Pei

(The 3th People’s Hospital of Hubei,Wuhan 430032,China)

Objective:To explore the effect of Huanglianjiedutang(HLJDT) on gene expression of β-APP for APP/PS1 double transgenic mice Alzheimer’s disease(AD) mouse model.Methods:3 months’old APP/PS1 double transgenic mice were used as AD models and were randomly divided into model control group(CMC group),western medicine Aricept control group (positive control group),HLJDT large dose group (large HLJDT group),HLJDT middle dose group (middle HLJDT group),HLJDT small dose group (small HLJDT group).The effect of HLJDT onβ-APP gene expression for AD mice model by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR).Results:Gene expression of β-APP increased in the CMC group. HLJDT of the three different dose groups compared with the AD model group,the difference was significant (P<0.05),that all can reduce the content of β-APP mRNA.Meanwhile,middle HLJDT group was the most significant.Conclusion:HLJDT can reduce the expression of β-amyloid precursor protein gene,and the effect of middle dose was better than aricept.

Huanglianjiedutang;APP/PS1 Double Transgenic Mouse Model of Alzheimer's Disease;β-amyloid Precursor Protein Gene;Gene Expression

2015-07-14

馮佩(1985-)，女，湖北省第三人民醫(yī)院住院醫(yī)師，研究方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合。

馮 佩

(湖北省第三人民醫(yī)院，湖北 武漢 430032)

R285.5

A

1673-2197(2015)24-0014-03

10.11954/ytctyy.201524006