神經生長因子和腦源性神經營養因子對神經干細胞遷移的影響①

魏春杰，江清林，朱曉峰

(佳木斯大學附屬第一醫院神經三科，黑龍江 佳木斯 154003)

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神經生長因子和腦源性神經營養因子對神經干細胞遷移的影響①

魏春杰，江清林，朱曉峰

(佳木斯大學附屬第一醫院神經三科，黑龍江 佳木斯 154003)

目的:探討神經生長因子(nervegrowthfactor，NGF)與腦源性神經營養因子(brain-derivedneurotrophicfactor，BDNF)體外實驗對神經干細胞遷移的影響。方法:體外應用半固體培養法連續14天觀察不同濃度的NGF、BDNF及NGF+BDNF組合誘導神經干細胞遷移的情況。結果:體外條件下不同濃度的神經營養因子的組間和組內比較顯示，100μg/LBDNF誘導神經干細胞遷移作用最明顯。BDNF+NGF聯合組在誘導神經干細胞遷移方面未見協同效應。結論:NGF、BDNF二者皆有誘導神經干細胞遷移的作用，100μg/LBDNF組誘導遷移作用最明顯。

神經生長因子；腦源性神經營養因子；神經干細胞；遷移

神經干細胞是神經科學領域研究的熱點問題，它的發現為神經系統疾病治療開拓了新的前景[1，2]。其增殖、定向誘導分化研究方面都取得了一定的成績，但針對神經干細胞遷移方面的研究較少。本實驗在體外條件下探討不同濃度的NGF、BDNF及其組合誘導NSCs遷移中的作用，并對兩種因子及組合進行擇優，選出最佳濃度的因子，為下一步體內實驗奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

Wistar新生鼠，由本校動物實驗中心提供。 主要試劑：DMEM/F12、B27、熒光FITC標記試劑，DAB顯色試劑，BrdU、NSE、nestin、GFAP一抗，SABC-FITC、SABC-CY3，EGF、bFGF、BDNF因子，羊抗小鼠Cy3，低熔點瓊脂糖。

1.2 方法

神經干細胞的分離及培養：選用Wistar新生鼠，取海馬組織，經D-Hanks，液漂洗后將腦組織置入小瓶中剪碎，加入無血清培養基吹打成單細胞懸液，臺盼蘭染色計數，于每個培養瓶中加入密度約為5×105/mL細胞懸液4mL左右。置于37℃、5%CO2飽和濕度孵育箱內培養。待原代克隆形成后再次分離制作單細胞懸液，此后每隔3d半量換液，5～7d分離神經球進行傳代[3]。

半固體培養：①取蓋玻片置于3.5cm培養皿底部，基本培養液為含0.3%低熔點瓊脂和2%B27的DMEM/F12(撤走bFGF)。在蓋玻片上用5%的瓊脂和神經營養因子(neurotrophicfactor，NTF)制成NTF擴散源，將傳代三代后得神經干細胞分散放置于NTF擴散源周圍的蓋玻片上，培養于基本培養液中，觀察不同因子不同濃度制成的擴散源誘導NSCs遷移情況，并跟蹤觀察各組實驗細胞遷移行為及形態學變化[4]。

②分組：BDNF：濃度1μg/L、10μg/L、100μg/L，共3組。NGF： 濃度1μg/L、10μg/L、100μg/L，共3組。BDNF+NGF：從上述六組中篩選出兩種因子的最佳濃度組成1組。空白對照組：不加任何NTF。

免疫細胞組織化學及熒光實驗：nestin標記：將傳代三次后的細胞團貼壁培養48h后進行nestin免疫細胞化學鑒定。數碼照相機拍照，各組均設陰性對照，陰性對照切片以PBS替代一抗，其余步驟相同。

1.3 統計學方法

2 結果

連續14d觀察接種在培養皿上的神經干細胞，見細胞生長狀態良好，倒置顯微鏡下細胞折光性強 (見圖2) 。神經干細胞球貼壁培養后24h，作Nestin免疫熒光鑒定絕大部分細胞顯示nestin陽性細胞團呈綠色，遷出分化的NSCs呈陰性(見圖1)。BrdU標記移植前之神經干細胞，免疫組化見大量神經細胞呈胞核被染色而胞漿未被染色Brdu標記陽性細胞，少部分未被標記。(見圖3)。鏡下見BDNF各組神經元樣細胞多，胞體面積大，突起長，14d時胞體多呈現三角行或多邊形，分支豐富。NGF各組細胞呈現類圓形或類星形，胞體較大，細胞伸出較多突起并逐漸延長，突起末端分支可見膨大的生長錐。鏡下觀察見BDNF組及NGF組細胞遷出均有方向性趨勢，但不同濃度的因子誘導NSCs遷移現象是有差別的。高濃度組中細胞團細胞向培養皿中心即因子擴散源方向遷出趨勢明顯，向這一個方向伸出的突觸也較長較粗。這種效果距離因子越近就越明顯，部分干細胞球團伸出類柱狀的突起，遷向因子方向。各濃度組細胞突起均隨時間推移逐漸增長，100?g/LBDNF組誘導遷移距離最長可達1200μm以上(見圖4)。而對照組干細胞團的細胞是向四周均勻分散遷出的，與實驗組相比較遷移距離較近(見圖5)。

圖1 圖2 圖3

圖1 神經干細胞球團的nestin免疫熒光染色，遷出分化的NSCs呈陰性。(×100)

圖2 原代培養3d時懸浮生長的神經干細胞漸聚集成不規則的球形細胞團，細胞結合疏松(×200)

圖3 神經干細胞的BrdU免疫組化染色，胞核著色，DAB顯色。(×100)

圖4 圖5

圖4 鏡下觀察見100μg/LBDNF組神經干細胞具有向BDNF因子中心方向遷移的趨向性(×200)

圖5 對照組中半固體培養24h，基礎培養液的中神經干細胞有向四周分散遷出趨勢，無明顯方向性。 (×200)

每組取距離因子擴散源1.5mm內的10個干細胞球團遷移距離的平均值：(×100)

表1 14d時不同組別遷移距離平均值

*：與對照組比較，P<0.05。

組內比較：①1μg/LNGF與10μg/LNGF兩濃度組誘導遷移作用比較，差異無顯著性(P>0.05)，但二者與100μg/LNGF誘導遷移作用比較(P<0.01)。②BDNF各濃度組差異皆有顯著性(P<0.01)，提示BDNF對神經干細胞的誘導遷移作用具有濃度依賴性。 組間比較：除1μg/LBDNF外，其余所有實驗組與對照組比較(P<0.05)，說明神經生長因子與腦源性神經營養因子具有誘導神經干細胞遷移的作用。100μg/LBDNF與(100μg/LNGF+100μg/LBDNF)兩組作用皆優于100μg/LNGF(P<0.05)，而100μg/LBDNF組與(100μg/LNGF+100μg/LBDNF)組合之間比較(P<0.05)差異無顯著性。本實驗未觀察到兩種因子在誘導神經干細胞遷移方面有協同效應。

3 討論

神經干細胞的遷移機制非常復雜，目前主要有放射狀遷移和正切遷移兩種模式[5]。NGF通過物理和化學兩個方面對神經前體細胞遷移起誘導作用。①物理因素方面：即神經前體細胞沿著放射狀膠質細胞的長突起方向遷移。NGF僅出現在遷移期的神經前體細胞中，其受體erb表達于遷移期的放射狀膠質細胞，阻斷受體erb后，神經前體細胞遷移受到抑制。外源性的NGF還可穩定原來的突觸接觸和防止突觸可塑性變化[6]。②在化學因素方面：即神經前體經細胞沿著化學趨化物的方向發生遷移。神經生長因子的彌散濃度梯度為神前體細胞的遷移提供了化學信號，研究表明，表達高親和力受體TrkA的鼠脊索成神經元細胞， 在低濃度的NGF誘導下即能沿著化學梯度直接發生遷移[7]。 有研究表明，BDNF能觸發干細胞的趨化和運動[8]。BDNF的主要作用位點是在中樞神經系統的突觸上，其不僅能促進突起的再生，而且能提高神經元表面BDNF受體TrkB的表達水平，其對突觸的延伸作用強于NGF[9]。這正與本實驗體外條件下100μg/LBDNF誘導神經干細胞遷移作用優于100μg/LNGF的結論相符。BDNF在神經系統可塑性及祖細胞遷移中起至關重要的作用。在神經元遷移時期，腦皮質內存在BDNF高親和力受體TrkB及BDNFmRNA，研究表明，TrkB高親和力受體主要存在于有遷移細胞的區域，許多TrkB陽性細胞均表現出典型遷移神經元的特性[10]。我們認為，BDNF的濃度與其受體TrkB的表達有直接的關系，是BDNF在誘導神經干細胞遷移方面存在濃度依賴性的原因。

本實驗表明神經營養因子BDNF對體外培養的神經干細胞遷移誘導作用優于NGF，且神經干細胞遷移對其存在濃度依賴性。結論提示BDNF可在NSCs準確到達病灶部位，修復損傷組織方面起到積極的作用，為如何應用NSCs治療神經系統疾病提供新的思路。

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[3]徐忠燁，朱曉峰.新生大鼠海馬神經干細胞的分離培養及鑒定[J].黑龍江醫藥科學，2002,25(5):2-4

[4]張曉梅,金玉玲,朱曉峰. 體外培養海馬神經干細胞分化前后離子通道檢測[J].黑龍江醫藥科學,2005,28(1):4-5

[5]胡旭慧,黃昕艷,朱曉峰.AB25-35寡聚體對原代培養海馬神經元突觸的損傷作用[J].黑龍江醫藥科學,2010,33(3):113

[6]張素，陳崇宏，鄭至.神經生長因子的研究[J].海峽藥業，2003,15(2):8-10

[7]陸艷紅.神經生長因子及其受體的神經發育調節[J].中國兒童保健雜志，2003,11(6):397-398

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黑龍江省教育廳資助項目，編號：12521543。

魏春杰(1980～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，主治醫師。

朱曉峰(1963～)男，山東蓬萊人，博士，教授，博士研究生導師。E-mail:sjkx2727@163.com。

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