苦碟子注射液對兔下頜骨骨折愈合的影響①

段 峰，劉德軍 (.佳木斯大學附屬第二醫院口腔醫院，黑龍江 佳木斯 5400；.佳木斯大學研究生學院口腔醫學專業，黑龍江 佳木斯 5400)

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苦碟子注射液對兔下頜骨骨折愈合的影響①

目的：探討苦碟子注射液在兔下頜骨骨折愈合恢復過程中的影響。方法：健康的新西蘭大白兔30只,兔的年齡11～12w,體重2.2～2.5kg。隨機分為A、B組,每組15只(雌雄不限),A組為實驗組,B組為對照組。在兔的左側下頜骨體部做2.0mm×10.0mm的骨折模型。A組建模術后第2日開始每天1次給予腹腔注射苦碟子注射液(10mL/kg),B組作為對照組不做任何處理。各組分別在術后1w、3w、5w的時間點上截取兔的左側下頜骨行HE染色,骨形態發生蛋白(BMP-2)免疫組化學染色觀察,骨密度測定,X線測定和血清鈣素的測定。結果：術后3w、5w時A組的骨形態發生蛋白的表達效果均強于B組(P<0.05);術后1w、3w、5w各時間點的骨密度測定,3w、5w比較明顯,在5w時各組骨密度達最大值,A組骨密度值均高于B組(P<0.05);術后1w、3w、5w經X線測定評分A組優于B組(P<0.05);血清鈣素水平在1w、3w、5w時A組均較B組增高明顯(P<0.05)。結論：苦碟子注射液能積極有效的促進兔下頜骨骨折的愈合。

苦碟子注射液；兔；骨折愈合；BMP-2

隨著經濟的發展,交通的發達,車禍外傷造成的頜面部骨折已成為口腔頜面外科常見病和多發病。目前西醫主要通過骨折的內外固定,電刺激,生物原刺激等來修復骨組織的愈合再生。本實驗主要研究探討中藥制劑苦碟子注射液在兔下頜骨骨折術后恢復階段產生的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物、試劑、器材

新西蘭白兔30只(體質健康，雌雄不限),兔的年齡11～12w,重量2.2～2.5kg(大學動物實驗中心),苦碟子注射液(通化華夏藥業集團),Ⅲ型X線機(日本島津公司),骨密度掃描儀器(佳木斯大學附屬醫院),骨形態發生蛋白-2(BMP-2)抗體∕SABC免疫組化學試劑盒∕DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 兔下頜骨骨折模型的制備及實驗分組

實驗所用的30只新西蘭大白兔術前禁食水10h,禁食水10h后10%水合氯醛給予腹腔注射麻醉,(4mL/kg)，待其麻醉后術區消毒,遵循無菌操作步驟，于左側下頜骨體部用一次性手術刀切開下頜骨體部術區,剝離組織，顯露骨質,在下頜骨體部用牙科高速渦輪鉆制作2.0mm×10.0mm骨缺損斷裂模型。術區0.9%氯化鈉鹽水沖洗,檢查無異常后逐層縫合術區創口。術后隨機分為A、B組飼養(A為實驗組,B為對照組),每組15只。術后當日每組兔子連續5d給予慶大霉素4萬單位肌注,每日一次,隨時觀察術區傷口有無感染化膿跡象。術后第2日開始,A組每日給予苦碟子注射液腹腔注射(10mL/kg),每日一次 共35d。B組作為對照組不做任何處理。

1.3 檢測指標

1)血清鈣素含量的測定：兩組實驗兔子分別于術后1w、3w、5w,每組隨機抽取5只采取耳緣處的靜脈血2mL,4℃條件下靜置4h,于離心機中離心10min后取出(4000r/min),取上層血清液,測定其中骨鈣素含量。

2)骨密度與X線測定：術后1w、3w、5w,每組隨機抽取5只,以4%多聚甲醛心內灌注后處死,取左側下頜骨術區及兩端骨折標本長約2.5cm,骨密度掃描儀檢測每組兔子骨折處的骨密度值,X線片攝取(距離8cm,,曝光3s,電壓50kV,電流30mA),對每組骨折愈合情況進行對比分析。

3)組織學觀察：術后1w、3w、5w切取的骨折部位標本待骨密度測定完成后,10%多聚甲醛固定20h后,13%螯合劑脫鈣液脫鈣20d, 80%、90%、95%、100%各種濃度乙醇梯度脫水2h，將包埋框合成模型槽，放入組織注入石蠟包埋,附加標簽，將修正好的蠟塊放在金屬持蠟器上制成厚約6μm的切片,將切片行蘇木素-伊紅染色,在光鏡下觀察骨折處骨痂中膠原的沉淀和軟骨的生成狀況,采集新生的骨小梁圖像,用圖像分析軟件進行分析,逐個算出視野中新形成的骨占原有骨面積百分比。免疫組化檢測 部分切片行骨形態發生蛋白免疫組織化學染色,測量其灰度值。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 血清鈣素測定

術后1w、3w、5w分別采取兩組兔耳緣靜脈血，1wA,B組的血清鈣素水平呈平穩緩慢增高,3wA組增長幅度較B組更明顯, 術后5w血清鈣素水平達最大值，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 術后1w、3w、5wA,B組血清鈣素測定

組別1W3W5WA3.82±0.274.26±0.314.75±0.42B2.51±0.152.95±0.263.34±0.28

與B組比較P<0.05。

2.2X線顯示結果

術后1w,A、B兩組骨折處X線片上骨折痕跡明顯,未見斷端橋接,A組骨折處新形成骨痂面積略大于B組。術后3w,A組術區骨折痕跡變得模糊,骨折處有連續的大面積骨痂形成,骨折處已橋接,B組骨折處仍可見骨折線,骨痂體積較小,骨折斷端才開始橋接。術后5w,A、B兩組骨折處均已橋接,A組骨折處新形成的骨痂體積較大, 骨折處塑形較好，密度接近于皮質骨,部分髓腔出現再通,骨折痕跡基本消失不見,恢復程度達骨性愈合標準,B組在骨折處骨痂形成體積相對較小,骨折處骨痂密度較低,塑形略差，各方面均明顯不及A組,見圖1。術后各時間點A組X線評分高于B組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 X線評分標準

與B組比較P<0.05

A組術后1W A組術后3W A組術后5W

B組術后1W B組術后3W B組術后5W

2.3 骨密度測定

術后1w、3w、5w2組實驗動物骨折處的骨痂密度及灰度值均呈現增長趨勢,其中注射藥物的A組較對照組B增長明顯,差異有統計學意義(P<0.05),在實驗5w達最大值,見表3。

表3 術后不同時間骨密度及BMP-2免疫組織化學灰度值

與B組比較P<0.05

2.4HE染色觀察

HE染色后5w,A組骨折斷端處可見大量軟骨細胞,骨細胞,軟骨基質,且有大量編織骨與板層骨,A組可見連續且粗大的骨小梁,表面見成骨細胞,B組骨小梁發育生長較差,骨小梁細小且數量少,連續性較低。

2.5BMP-2免疫組織化學觀察

術后1w、3w,A組骨痂呈肥大型較B組明顯,骨化區骨形態發生蛋白呈陽性,5w時陽性較明顯,B組呈弱陽性,術后1w、3w、5w,A組骨形態發生蛋白免疫組化灰度值均大于B組,術后3w、5w差異有統計學意義(P<0.05),見表3。

3 討論

臨床工作中,由于腫瘤、外傷、炎癥等造成的骨缺損是醫生常見問題。骨缺損的延期愈合或者不愈合常常困擾患者及臨床醫生,如何更好、更快的使骨折盡早愈合一直是大家探討的熱門課題。本實驗主要探討中藥制劑對骨折缺損修復的影響。骨折愈合是復雜的修復過程, 骨折后骨折端及周圍組織將出現炎癥反應、血腫機化、細胞增生及鈣化等一系列過程，最后恢復骨的連續性，達到骨愈合。骨折愈合是一個很復雜的問題，受多種因素的影響。各個階段均是有典型的生物學及組織學特征,該過程是各種因素相互協同、拮抗的結果。因此,我們探討一種藥物對骨折愈合的影響,應從多方面進行檢測。實驗中X線片觀察示苦碟子注射液可使骨折斷端處鈣鹽沉積量增加,增加骨痂形成體積和范圍，加快骨小梁生長和重建。骨力學強度體現了骨組織密度的高低,本實驗中苦碟子注射液對骨密度起到促進作用,增加骨折區骨力學強度。血清鈣素與骨鈣素含量成正相關,血清中骨鈣素的含量對了解骨生理、代謝的變化及成骨細胞功能狀態是有一定意義的。苦碟子注射液能顯著促進成骨細胞活性,加速礦化進程,骨形態發生蛋白是骨缺損修復再生的重要生長因子,主要起誘導間充質細胞的分化增殖為成骨細胞,促進成骨細胞分化和膠原合成,形成新骨。因此,通過檢測實驗中骨形態發生蛋白含量就可以大致掌握骨痂形成狀況。A組3w、5w時,骨折區骨形態發生蛋白含量明顯高于B組,且差異有統計學意義。說明苦碟子注射液通過促進骨細胞形成來加速骨折愈合進度。綜上所述,從動物實驗結果來看,苦碟子注射液可以明顯的增加骨折區骨痂面積、成骨細胞數量、骨小梁密度和塑性情況,顯著提高骨折處骨密度,礦物質含量,促進骨形態發生蛋白表達,有利于骨折愈合。

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段峰(1972～)男，黑龍江佳木斯人，副教授，碩士研究生導師，副主任醫師，主要從事口腔頜面外科臨床及研究工作。

劉德軍(1981～)男，黑龍江哈爾濱人，在讀碩士研究生。E-mail：394133047@qq.com。

段 峰1，劉德軍2(1.佳木斯大學附屬第二醫院口腔醫院，黑龍江 佳木斯 154002；2.佳木斯大學研究生學院口腔醫學專業，黑龍江 佳木斯 154002)

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