高強度聚焦超聲阻滯腰交感神經節對后肢動脈閉塞動物模型脊髓P物質和外周血β-內啡肽的影響

傅 洪，魏安寧，李發琪，王智彪

(1.重慶市中醫院麻醉科 400021；2.重慶醫科大學附屬第二醫院麻醉科，重慶 400010；3.重慶醫科大學超聲生物醫學工程研究所，重慶 400016)

?

·論 著·

高強度聚焦超聲阻滯腰交感神經節對后肢動脈閉塞動物模型脊髓P物質和外周血β-內啡肽的影響

傅 洪1，魏安寧2，李發琪3，王智彪3

(1.重慶市中醫院麻醉科 400021；2.重慶醫科大學附屬第二醫院麻醉科，重慶 400010；3.重慶醫科大學超聲生物醫學工程研究所，重慶 400016)

目的 探討高強度聚焦超聲(HIFU)行腰交感神經節阻滯對周圍動脈閉塞動物血漿β-內啡肽(β-EP)及脊髓P物質(SP)的影響。方法 26只家犬按隨機數字表法隨機分為三組：HIFU治療組(A組,n=12)，非治療組(B組,n=12)，正常對照組(C組,n=2)。A、B兩組建立后肢缺血動物模型,A組術后2周采用HIFU阻滯第2～6腰交感神經節，B組不予處理。A、B兩組每次隨機選2只犬在治療后不同時間點采用放射免疫法檢測血漿β-EP，取腰段脊髓行免疫組織化學染色檢測SP變化；C組直接檢測。結果 (1)A、B兩組在造模后2周血漿β-EP水平均低于C組(P<0.01)，治療后A組不同時間點β-EP水平高于B組(P<0.05)。(2)脊髓SP陽性表達主要分布在脊髓背角Ⅰ、Ⅱ層。A、B兩組在造模后2周脊髓腰段SP的OD值明顯高于C組(P<0.01)，HIFU干預后A組脊髓腰段SP的OD值低于B組(P<0.05)。(3)犬周圍動脈閉塞缺血后血漿β-EP與脊髓SP的變化呈負相關。結論 HIFU阻滯腰交感神經節治療慢性周圍動脈閉塞缺血動物模型，可有效升高血漿β-EP水平和降低脊髓SP水平，提高痛覺閾值，減輕疼痛。

后肢動脈閉塞； 腰交感神經節阻滯； P物質； β-內啡肽； 疼痛

高強度聚焦超聲 (HIFU)具有熱效應(10 s內，焦閾溫度可超過70 ℃)和空化效應及無創、精確、可重復、對大血管影響小等特點，在一定條件下處理機體組織可達到徹底阻滯的效果。有研究在國內開展了HIFU作用于神經的動物實驗，結果表明HIFU能夠阻斷兔坐骨神經及腹腔神經節的傳導,并且阻滯程度與劑量呈量效關系[1-2]。傅洪等[3-4]首次報道了利用HIFU實現體外毀損犬腰交感神經節的實驗研究，本研究擬在此基礎上，觀察HIFU治療后一定時間內血漿β-內啡肽(β-EP)及脊髓P物質(SP)的改變并分析其相關性，從而在分子層面了解腰交感神經阻滯(LSGB)的影響，揭示HIFU治療周圍動脈閉塞缺血性疾病及其疼痛可能的作用機制，為其臨床中的應用提供理論根據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 選擇健康成年雜種犬26只，由重慶醫科大學實驗動物中心購買，體質量13～16 kg，隨機分為三組：治療組(A組，n=12)；非治療組(B組，n=12)；正常對照組(C組，n=2)。

1.2 試劑與儀器 (1)846合劑，由長春軍事醫學科學院生產，批號吉獸藥試字(2008)005013；(2)血漿β-EP試劑盒由第二軍醫大學神經生物學教研室提供；(3)SP試劑盒購于中杉金橋生物技術有限公司(北京)；(4)SABC免疫組織化學試劑盒和DAB顯色劑均購于博士德生物技術工程有限公司(武漢)；(5)高強度聚焦超聲腫瘤治療機(重慶海扶公司，型號JC，0～15 000 W 可調)。

1.3 方法

1.3.1 A組和B組均按文獻[5]建立下肢缺血動物模型 術前常規禁食12 h，禁飲6 h，846合劑(0.15 mL/kg)麻醉起效后，仰臥、四肢外展并固定，腹股溝區常規消毒鋪巾；沿左股動脈行徑逐層切開分離，游離出股動脈，結扎、切斷其所有分支，20 G留置針于股動脈向遠心端穿刺，置入螺旋狀金屬絲(長20 cm,外徑0.8 mm)1根并縫合固定，縫扎股動脈切口使其縮窄一半，逐層縫合。造模后第8天A、B兩組經腹應用銀夾標識左側第2～6腰交感神經節，標記后7 d A組在麻醉狀態下應用HIFU治療機對第2～6腰交感神經節分別處理300 s，處理聲強為2 123 W/cm2，術中均以青霉素靜脈滴注。

1.3.2 血漿及脊髓標本制備 待動物完全麻醉后,(1)抽右側股靜脈血4 mL即刻注入含0.3 mol/L的乙二胺四乙酸二鈉40 μL和抑肽酶2 000 U預冷塑料試管內，4 ℃離心后取上清液，保存于-40 ℃冰箱。(2)迅速開胸，經左心室插管至主動脈，剪開右心耳，予以生理鹽水灌注至流出液清亮，再灌注40 g/L多聚甲醛(pH=7.4)固定1 h后,取材患側L1～L5脊髓置入40 g/L多聚甲醛中固定4 h，后投入200 g/L蔗糖液中過夜。冷箱中對標本進行20 μm連續切片。

1.3.3 檢測方法 (1)血漿β-EP用放射免疫法測定；(2) 脊髓SP免疫組織化學測定：參照SABC免疫組織化學試劑盒中流程要求操作，滴加一抗濃度為1∶500，DAB顯色，復染后封片。另以PBS和10%山羊血清替代第一抗，分別作為陰性對照和替代對照。OlymPus BX50顯微鏡觀察染色結果并攝片。使用定量顯微鏡570(Leica)圖像分析軟件測量SP陽性區平均光密度。每側背角高倍鏡下隨機選取5個視野，分別測定SP陽性表達OD值并計算均值。

2 結 果

2.1 血漿β-EP水平變化 A組2只動物分別于造模后6 d和治療后4 d死亡，B組1只在造模后9 d死亡。A組存活10只與B組存活11只動物在造模后2周(治療0周)β-EP水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)，但均低于C組(P<0.05)。治療1周后A組β-EP水平逐漸升高，并在對應時間點與B組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，并且隨時間推移，至治療后4周基本達到造模前水平(P>0.05)，而B組呈下降趨勢，2周時比較差異有統計學意義 (P<0.05)。見表1。

2.2 脊髓SP的分布及水平變化 脊髓SP陽性表達主要分布在脊髓背角Ⅰ、Ⅱ層，呈棕黃色顆粒狀、條索狀和串珠狀分布，對照組陽性表達少。A、B兩組在造模后2周脊髓腰段SP的OD值差異無統計學意義(P>0.05)，但均明顯高于C組(P<0.05)。治療1周后A組SP的OD值逐漸下降，并在相應時間點與B組差異有統計學意義(P<0.05)，隨著時間的推移，至2周時基本達到造模前水平(P>0.05)；而B組呈上升趨勢，4個月時上升最明顯(P<0.05)。見表2。

表1 三組各時點血漿β-EP水平比較

注：與C組相比，△P<0.05；同時點與B組相比，*P<0.05；-表示無數據。

表2 三組脊髓背角SP的OD值在不同時點的變化

注：與C組相比，△P<0.05；同時點與B組相比，*P<0.05;-表示無數據。

2.3 血漿β-EP與脊髓SP的關系 血漿β-EP與脊髓SP呈明顯負相關，A組r=-0.628，P<0.05；B組r=-0.701，P<0.01。

3 討 論

周圍動脈閉塞性疾病是臨床常見疾病，70歲以上老年人發病率達15%～20%[5-6]。臨床癥狀主要表現為5P征，其中疼痛(短距離運動痛甚至靜息痛)表現尤為明顯，治療原則為控制病因、改善和增進下肢血液循環[7]。研究表明，腰交感神經鏈具有收縮血管、增加血管阻力及減少血流量等作用，腰交感神經切除術因能消除動脈痙攣使機體血管擴張、改善患肢局部的血供，是目前此類疾病的有效治療措施[2,8-10]。

SP和β-EP均為中樞神經系統中調控疼痛的重要物質。SP作為痛感遞質，不但具備多種生物學效應，如導致疼痛、降低血壓、擴張血管和毛細血管通透性增加等[11]，而且在高級神經中樞及其下行調制中發揮鎮痛功能[12]。SP及其受體豐富地分布在脊髓Ⅰ、Ⅱ和Х層。內源性阿片肽有三大家族成員，其中β-EP具有強烈的麻醉鎮痛作用[13]。在一項橫斷面研究中發現慢性神經性疼痛患者腦脊液和血漿中β-EP水平明顯低于正常健康者，β-EP水平的降低導致痛域降低，反而增加對疼痛的敏感性[14]。另一項對偏頭痛患者配對治療的研究發現，偏頭痛患者，尤其是慢性偏頭痛患者，其基礎血漿β-EP水平較低，經治療后偏頭痛癥狀改善，β-EP水平增加[15]。本研究觀察到下肢缺血模型建成后，動物活動性降低，還存在不同程度跛行，結果中發現動物模型組(A、B兩組)血漿β-EP水平明顯低于正常對照組，而腰段脊髓SP的OD值明顯高于對照組，經HIFU治療后血漿β-EP逐漸上升，而脊髓SP下降，與上述相關研究相仿。本研究還注意到，肢體慢性缺血時脊髓SP水平與血漿β-EP呈明顯負相關。其機制可能是缺血缺氧導致感覺神經末梢刺激增加，繼而引發疼痛，急性期時，脊髓釋放的SP和降鈣素基因相關肽(CGRP)共同進入血，誘發內皮細胞釋放一氧化氮(NO)，NO作用于血管產生舒張平滑肌、增加血流量等效應，進而引起后角P物質產生減少[16]。與此同時，中樞性鎮痛物質β-EP釋放增加，不但產生比等量嗎啡強20倍的直接鎮痛作用[17]，還通過抑制P物質的釋放和交感神經系統活動及其介質的釋放發揮間接鎮痛作用[18]。在疼痛的慢性期，β-EP水平的升高減少脊髓P物質的釋放，導致脊髓后角P物質積聚，SP通過負反饋抑制中樞β-EP的釋放，降低血漿中的β-EP水平。HIFU阻滯腰交感神經節治療，一方面使機體血管擴張，改善局部的血供，減輕炎性反應和對痛覺神經末梢的參加，另一方面促進神經末梢CGRP和SP釋放增加，通過正反饋進一步促進β-EP釋放，終止了缺血疼痛的惡性循環，降低脊髓后角SP水平，β-EP也逐漸恢復至接近正常水平[19]。

總之，HIFU阻滯腰交感神經節治療慢性周圍動脈閉塞缺血動物模型，可有效升高血漿β-EP水平和降低脊髓SP水平，提高痛覺閾值，減輕疼痛。而有關治療的詳細分子機制尚有待進一步研究。

[1]李信明,魏安寧,陸杰,等.高強度超聲損傷兔坐骨神經后恢復情況的實驗研究[J].中華麻醉學雜志，2004,24(3)：198-202.

[2]曾令全,魏安寧,傅洪,等.高強度聚焦超聲和乙醇阻滯腹腔神經節對內臟大神經放電的影響[J].重慶醫科大學學報，2006,31(2):141-144.

[3]傅洪,魏安寧,李發琪，等.高強度聚焦超聲與無水乙醇毀損腰交感神經節對犬后肢動脈閉塞病變影響的比較研究[J].中國疼痛醫學雜志，2007,13(2):96-101.

[4]傅洪,魏安寧,李發琪,等.高強度聚焦超聲阻滯犬腰交感神經節的實驗研究 [J].檢驗醫學與臨床，2010,7(5):395-399.

[5]Bian JF,Ang ZD,Ning MF.Constructed model of canine ischemic hind extremity [J].Chin J Exp Surg，1996,13(6):325-326.

[6]Selvin E,Erlinger TP.Prevalence of and risk factors for peripheral arterial disease in the United States:results from the National Health and Nutrition Examination Survey,1999～2000[J].Circulation,2004,110(6):738-743.

[7]Forsythe RO,Hinchliffe RJ.Management of peripheral arterial disease and the diabetic foot [J].J Cardiovasc Surg,2014,55(2):195-206.

[8]劉青龍，秦振龍，王繡伯，等.補陽還五湯與腰交感神經節切除對坐骨神經損傷模型大鼠足部皮膚溫度的影響[J].河北中醫，2013，35(1)：110-111.

[9]姚秀高，周永高，陳建龍，等.腰交感神經毀損治療下肢交感神經維持性疼痛的臨床研究[J].中國疼痛醫學雜志，2014,20(6)：434-436.

[10]Straube S,Derry S,Moore RA，et al.Cervico-thoracic or lumbar sympathectomy for neuropathic pain and complex regional pain syndrome[J].Cochrane Database Syst Rev，2013,2(9):291-298.

[11]Chen K,Zhang ZF,Liao MF,et al.Blocking PAR2 attenuates oxaliplatin-induced neuropathic pain via TRPV1 and releases of substance P and CGRP in superficial dorsal horn of spinal cord[J].J Neurol Sci，2015，352(1/2):62-67.

[12]李仲廉.臨床疼痛治療學[M].2版.天津:天津科學技術出版社,2004:12.

[13]楊帆，李雅琴，劉孝兵，等.肉毒毒素治療帶狀皰疹后神經痛的療效觀察及其對血漿β-內啡肽的影晌[J].河北醫學，2014，20(6)：937-940.

[14]B?ckryd E,Ghafouri B,Larsson B,et al.Do low levels of beta-endorphin in the cerebrospinal fluid indicate defective top-down inhibition in patients with chronic neuropathic pain? A cross-sectional,comparative study [J].Pain Med,2014,15(1):111-119.

[15]Misra UK,Kalita J,Tripathi GM,et al.Is β endorphin related to migraine headache and its relief [J].Cephalalgia,2013,33(5):316-322.

[16]Kobayashi Y,Sekiguchi M,Konno S,et al.Increased intramuscular pressure in lumbar paraspinal muscles and low back pain:model development and expression of substance P in the dorsal root ganglion[J].Spine，2010,35(15):1423-1428.

[17]Bruehl S,Burns JW,Chung OY,et al.What do plasma beta-endorphin levels reveal about endogenous opioid analgesic function[J].Eur J Pain,2012,16(3):370-380.

[18]Chavarría-Bolaos D,Martinez-Zumaran A,Lombana N,et al.Expression of substance P,calcitonin gene-related peptide,β-endorphin and methionine-enkephalin in human dental pulp tissue after orthodontic intrusion:a pilot study [J].Angle Orthod,2014,84(3):521-526.

[19]Russell FA,King R,Smillie SJ,et al.Calcitonin gene-related peptide:physiology and pathophysiology [J].Physiol Rev,2014,94(4):1099-1142.

Effect of lumbar sympathetic ganglion blocking with high intensity focused ultrasound on substancep of spinal cord and β-endorphine of peripheral blood in hind limb arterial occlusion animal model

FUHong1,WEIAn-ning2,LIFa-qi3,WANZi-biao3

(1.DepartmentofAnesthesiology,ChongqingHospitalofTraditionalChineseMedicine,Chongqing400021,China;2.DepartmentofAneshesiology,SecondAffilialedHospitalChongqing400010,China;3.UtrasoundBiomedicdEngineeringResearchInstitute,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

Objective To observe the effect of lumbar sympathetic ganglion blocking with high intensity focused ultrasound(HIFU)on substance P(SP)of spinal cord and β-endorphine(β-EP)in blood plasma in arterial occlusion animal model.Methods 26 canis familiaris were randomly assigned to 3 groups:HIFU therapy group (group A，n=12),non-therapy group (group B，n=12) and normao control group (group C，n=2).In group A and B,the arteria cruralis was liberated and all branches (including arteria profunda femoris) were cutted,then a helical tinsel was inserted into the arteria.In group A,the 2nd ～ 6th ganglion sympatheticums were blocked with HIFU after postoperative 2 weeks.In every time point after the therapy,2 dogs were randomly selected from groups A and B every time for β-EP examination,and then the spinal cord SP was detected,dogs in group C were directly detected.Results (1) Comparison with the group C,β-EP in the groups A and B was significantly decreased (P<0.01),β-EP in the group A was higher than that in the group B after therapy(P<0.05).(2) In the groups A and B,SP was located in the I,Ⅱ layers of dorsal horn in spinal cord,postoperative average optical density(OD) of SP was significantly higher than that in the group C (P<0.01);the OD in the group A was less than that in the group B after therapy (P<0.05).(3) In the model dog of arteria occlusion,blood plasma β-EP was negative correlated with the SP in the spinal cord.Conclusion Lumbar sympathetic ganglion blocking for hind limb arterial occlusion animal model by HIFU can increase blood plasma β-EP and decrease SP of spinal cord,and elevate the pain threshold value and then relieve pain.

hind limb aterial occlusive; lumbar sympathetic ganglion blocking; substance P； β-EP； pain

傅洪，男，碩士研究生，副主任醫師，主要從事臨床麻醉與疼痛治療。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.13.014

A

1672-9455(2015)13-1852-03

2015-03-20

2015-05-15)