應用EP6-A2方案評價自建檢測系統中尿蛋白的線性范圍

周遠青，梁瑞蓮，呂偉標，梁玉全，陳映慧

(南方醫科大學附屬順德第一人民醫院檢驗科，廣東順德 528300)

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·論 著·

應用EP6-A2方案評價自建檢測系統中尿蛋白的線性范圍

周遠青，梁瑞蓮，呂偉標，梁玉全，陳映慧

(南方醫科大學附屬順德第一人民醫院檢驗科，廣東順德 528300)

目的 建立自建檢測系統中尿蛋白的線性范圍，以供臨床檢驗做參考。方法 根據美國臨床和實驗室標準化協會(CLSI)頒發的EP6-A2文件，配制11組U-pro濃度為等間距排列的試驗標本，每個樣本重復測定2次，用SPSS軟件對數據進行多項式回歸，得出該項目的線性范圍。結果 自建檢測系統檢測尿蛋白重復性CV為1.59%，小于實驗室所規定的重復性目標2%，數據重復性好，符合實驗要求。實驗數據經多項式回歸分析后得出的最適模型為三次多項式，通過對其非線性度分析，判斷其為臨床可接受的線性，對應的自建檢測系統中檢測尿蛋白線性范圍為5.2～1 355.15 mg/L。結論 自建檢測系統中尿蛋白的線性范圍為5.2～1 355.15 mg/L，小于試劑盒說明書上的線性范圍0～2 000 mg/L。臨床實驗室應對檢測系統的分析性能進行評價，以保證其檢測結果的準確可靠。

尿蛋白； 線性范圍； EP6-A2方案； 自建檢測系統

根據“醫療機構臨床實驗室管理辦法”的要求，臨床實驗室所用的方法、儀器等應保證檢驗結果的準確可靠，臨床實驗室應對所用的方法學進行評價，以保證所選用的方法、試劑、儀器達到臨床性能、分析性能和經濟性能等各方面的要求[1]。分析性能主要包括精密度、準確性、特異性、抗干擾性、靈敏度、最低檢出限、線性范圍等，其中線性范圍是較為重要內容之一。自建檢測系統指實驗室根據自己的意愿選擇儀器、校準品、試劑等而建立的檢測系統。因本實驗室的自建檢測系統的線性范圍可能與試劑盒提供的線性范圍不相符，為了保證檢驗結果的可靠性，需要在檢驗前建立自建的檢測系統中檢驗項目的線性范圍[2]。本次實驗以尿蛋白為例，實驗準備、實驗過程和數據處理等根據美國臨床和實驗室標準化協會(CLSI)最新核準的線性判定指南EP6-A2方案設定[3]，此方案是利用多項式回歸分析判定線性，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 取尿蛋白濃度超過試劑說明書上線性檢測上限的高值(H)樣本和尿蛋白定性為陰性的低值(L)樣本。

1.1.2 儀器與試劑 儀器為日本Hitachi 7600-210型全自動生化分析儀；試劑為北京利德曼公司生產的腦脊液與尿蛋白測定試劑盒；校準品為試劑盒配套校準品。

1.2 方法

1.2.1 配制試驗樣品 用尿蛋白的高值(H)樣品和低值(L)樣本，取H、L按L、0.9 L+0.1 H、0.8 L+0.2 H、0.7 L+0.3 H、0.6 L+0.4 H、0.5 L+0.5 H、0.4 L+0.6 H、0.3 L+0.7 H、0.2 L+0.8 H、0.1 L+0.9 H、H的比例分別配制11組尿蛋白濃度為等間距排列的試驗樣本。

1.2.2 試驗測驗 將上述11組試驗樣品在自建檢測系統中按隨機順序進行各自項目的測定，每組樣品測試兩次。

1.3 計算

1.3.1 初步數據檢查

1.3.1.1 檢查數據是否有極端明顯的差異和錯誤，如有，找出原因并重做實驗。

1.3.1.2 以組數為X軸，測定濃度為Y軸繪制散點圖，檢查是否存在非常明顯的非線性；判定實驗數據有無明顯離群值。

1.3.1.3 計算重復性CV。

1.3.2 多項式回歸分析 逐點對數據做一次、二次和三次多項式回歸分析，其回歸方程分別為Y=b0+b1X(回歸自由度Rdf=2)、Y=b0+b1X+b2X2(回歸自由度Rdf=3)、Y= b0+b1X+b2X2+b3X3(回歸自由度Rdf=4)可以借助SPSS統計軟件完成。計算每個非線性系數斜率的標準差SEi(可由回歸程序算出)，然后進行t檢驗，判斷非線性系數是否有統計學意義，即與0之間有無差異。

1.3.3 計算線性偏差(DL) 當最適多項式不為線性時，要計算每個點的L。每個濃度處的DL計算如下：DLi=p(Xi)-(b0+b1Xi)，X的取值范圍從Xi到Xs，p(Xi)為最適多項式回歸模型在Xi處的值，因而DLi為在每個不同濃度處二次或三次多項式模型與一次多項式(線性)模型的差值。

1.3.4 統計學處理 采用SPSS18.0統計軟件處理，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 初步判斷未發現明顯的離群值。

2.2 計算CV經計算得出本實驗重復性CV為1.59%，小于實驗室所規定的重復性目標2%，數據重復性良好。

2.3 逐點回歸分析 當P<0.05時，系數b與0有明顯差異，該曲線符合此階數函數，此時，回歸標準誤越小，說明該模型為適合數據組。見表1。

表1 尿蛋白檢測線性范圍逐點多項式回歸

表2 每個濃度的線性偏離DL%值

注：-表示無數據。

2.4 計算線性偏離 第1點在四組模型DL%都大于5%，所以第1點不為線性范圍所接收。第1～5點模型中另外四點DL%小于5%，而第1～6點模型中DL3%大于5%，第1～7點模型中有四點DL%大于5%，綜上所述，本試驗測定的線性范圍為第1～5點，即5.20～1 355.15 mg/L。見表2。

3 討 論

近年來，越來越多實驗室按自己的意愿選擇檢測儀器、試劑、標準品組成自建檢測系統，所選擇的檢測儀器、試劑、標準品通常不配套或不完全配套，需對其測量分析線性范圍的進行重新評價。

EP6-A2是CLSI最新核準的線性判定指南，該方案判定線性的多項式回歸分析方法，從統計學和臨床要求兩個方面判定線性，其中涉及目測檢驗、測量數據的精確度檢驗和多項式回歸分析，此方法目前被認為是判斷線性的較好方法[4-6]。該方案規定當一個新的測量方法(廠家或實驗室改良一個實驗方法時)需要建立新的線性范圍時，需要7～11個能覆蓋預期的測量范圍的不同濃度的標本。生產商希望有更多的測量點(比預期的線性范圍寬20%～30%)，這樣能檢測到“拐點”，就能確定更寬的線性范圍。根據不精密度的大小，每個濃度水平測量2～4次。所以為了建立線性范圍，本實驗用高值和低值濃度的樣本按比例精確配成等間距的不同濃度的11個樣本隨機測定2次，選擇的測量濃度范圍包含或等于廠家所聲明的最低和最高濃度范圍[7]。

EP6-A2是利用多項式回歸分析判定線性。多項式回歸的最大優點是可以通過增加X的高階項對實測點進行逼近直至滿意為止，從而建立最優的多項式方程。另外，可在每個濃度水平判定非線性度。從本實驗可得，第1～4點和第1～5點模型并不為線性，但可以通過測其非線性度判斷其仍為臨床可接受的線性，所以用EP6-A2線性評價方案是非常客觀實用[8-9]。

結果可得出本實驗未發現離群值，重復測定比例誤差CV為1.59%，小于實驗室所規定的誤差目標2%，數據重復性好。第1～5點的數據經回歸分析后得出的最適模型為三次多項式，但通過對其非線性度分析，判斷其仍為臨床可接受的線性，最后得出尿蛋白的線性范圍為5.20～1 355.15 mg/L。得出的線性范圍小于試劑盒給的線性范圍0～2 000 mg/L，所以在臨床檢驗應用中建議大于1 300 mg/L時要稀釋復查。

實驗中用多項式回歸分析，得出的最適模型都不為線性模型，說明實驗過程中存在較大的誤差，但實驗重復性良好，原因可能為加樣不準確造成誤差。所以在實驗操作過程中，每個步驟都必須嚴格操作。也可能是基質效應影響了結果，Sviridow等[10]的研究表明尿液基質對檢測結果有很大影響，尤其是尿液離子強度，所以建議用患者尿液為L標本。11組試驗數據只有5組數據在線性范圍以內，說明實驗前尿蛋白H設置得太高，如果更多的點在線性范圍內，測得的線性范圍將更為精密。

[1]趙建忠．生化分析儀精密度、準確性以及線性范圍性能驗證[J]．國際檢驗醫學雜志，2011，32(10)：1111-1112．

[2]黃志宏，付文金，湯慧華，等．多項式線性評價在自建生化檢測系統中的初步應用[J]．檢驗醫學與臨床，2012，9(1)：93-96．

[3]CLSI.EP6-A2Evaluationofthelinearityofquantitativemeasurement procedures:a statistica approach.approved guideline[S].Wayne,PA:CLSI,2003.

[4]周琦，李少男，李小鵬，等．利用美國國家臨床實驗室標準化委員會EP6-A指南判定線性[J]．中華檢驗醫學雜志，2006，29(1)：85-86．

[5]張曉耕，王培昌，劉辰庚，等．ADVIA 2120全自動血球分析系統HGB、RBC及WBC線性范圍的測定與評價[J]．中國實驗診斷學，2009，13(5)：658-661．

[6]徐傳華．AU640檢測系統測定胱抑素C的分析測量范圍和臨床可報告范圍的驗證[J]．檢驗醫學與臨床，2010，7(22)：2501-2502．

[7]Tholen DW.Evaluation of linearity using the newly approve NCCLS EP6-A protocol[J].Clin Lab News,2004,30(16):10-12.

[8]呂賽平，劉琴，鄒學森．應用EP6-A2方法驗證血糖試劑盒的線性范圍[J]．實驗與檢驗醫學，2011，29(1)：45-46．

[9]邱方，張世忠，馮濤．COBA E601電化學發光檢測系統測定β-HCG的分析測量范圍和臨床可報告范圍的驗證[J]．臨床檢驗雜志，2008，26(5)：384-385．

[10]Sviridov D,Hortin GL.Urine albumin measurement:effects of urine matrix constituents[J].Clin Chim Acta,2009,404(2):140-143.

Application of EP6-A2 protocol for evaluating linear range of U-pro testing in self-built test system

ZHOUYuan-qing,LIANGRui-lian,LVWei-biao,LIANGYu-quan,CHENYing-hui

(DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedShundeFirstPeople′sHospital,SouthernMedicalUniversity,Shunde,Guangdong528300,China)

Objective To establish the linear range of U-pro in the self-built test system for clinical laboratory to provide reference for clinical detection.Methods 11 groups of sample were prepared according to the EP6-A2 document issued by the Clinical and Laboratory Standard Institute(CLSI),which had equal interval U-pro concentrations,every sample was tested twice.The data were conducted the polynomial regression for obtaining the linear range of U-pro by the SPSS software.Results TheCVof repeat test in the self-built test system was 1.59%,less than 2% which was ruled in the laboratory,the data were repeatable.After regression analysis on the data,the optimal model was the cubic polynomial,but through analyzing its nonlinearity,it was judged as the acceptable linearity for clinic.The corresponding linear range of U-pro in the self-built test system was 5.20-1 355.15 mg/L.Conclusion The linear range of U-pro in the self-built test system is 5.20-1 355.15 mg/L,which is less than the linear range of 0-2 000 mg/L provided by the kit instruction.Clinical laboratory should evaluate the analytical performance of testing systems to ensure the accuracy and reliability in the detection results.

U-pro; linear range; EP6-A2; self-built test system

周遠清，男，本科，主任技師，主要從事臨床生化檢驗工作。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.13.034

A

1672-9455(2015)13-1898-02

2015-01-25

2015-03-10)