產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌耐藥性分析及耐藥基因檢測(cè)

周 翼，魏 威

(1.四川省樂(lè)山市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科 614000；2.南方醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，廣州 5105155)

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·臨床探討·

產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌耐藥性分析及耐藥基因檢測(cè)

周 翼1，魏 威2

(1.四川省樂(lè)山市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科 614000；2.南方醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，廣州 5105155)

目的 分析產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)大腸桿菌的耐藥性，并檢測(cè)相關(guān)耐藥基因，為臨床合理用藥提供參考。方法 采用紙片擴(kuò)散法對(duì)樂(lè)山市中醫(yī)醫(yī)院的產(chǎn)ESBLs大腸桿菌分離、確認(rèn)；采用紙片擴(kuò)散法和自動(dòng)化儀器法對(duì)篩選出來(lái)的菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，探討產(chǎn)ESBLs大腸桿菌菌株對(duì)臨床常用藥物的耐受情況；采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)耐藥基因TEM、SHV 和CTX-M-1、CTX-M-2，了解分離得到的菌株的耐藥遺傳學(xué)特征，獲得醫(yī)院耐藥菌株的主要基因型。結(jié)果 經(jīng)患者的痰液、消化液、血液及切口膿液等處分離得到大腸桿菌164株，其中產(chǎn)ESBLs 104株。產(chǎn)ESBLs大腸桿菌對(duì)頭孢類抗菌藥物的耐藥率較高，其中頭孢他啶、頭孢拉啶、頭孢噻啶的耐藥率均為100.0%；對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥率較低，且對(duì)亞胺培南、美羅培南的耐藥率均為0，產(chǎn)ESBLs菌株對(duì)常見抗菌藥物的耐藥率明顯高于非產(chǎn)ESBLs菌株的耐藥率；產(chǎn)ESBLs菌中檢出CTX-M-2型41株(39.5%)、CTX-M-1型30株(28.9%)、SHV型18株(17.3%)和TEM型15株(14.4%)。結(jié)論 產(chǎn)ESBLs大腸桿菌在感染患者病原菌中占據(jù)一定的比重，其對(duì)常用抗菌藥物的耐藥率明顯高于非產(chǎn)ESBLs大腸桿菌，臨床應(yīng)加強(qiáng)對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的認(rèn)識(shí)，以指導(dǎo)臨床治療。

β-內(nèi)酰胺酶；大腸桿菌； 耐藥分析； 耐藥基因

隨著抗菌藥物的廣泛使用，大腸桿菌對(duì)常用抗菌藥物的耐藥性正在不斷增加，耐藥性大腸桿菌所致感染也已經(jīng)成為抗感染治療的巨大挑戰(zhàn)[1-2]。由于大腸桿菌目前為三甲醫(yī)院分離率第一的臨床菌株，其產(chǎn)生的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)由質(zhì)粒介導(dǎo),易在同種屬甚至不同種屬細(xì)菌間傳遞造成暴發(fā)流行，是患者感染治愈困難的主要原因[3]。近年來(lái)，隨著醫(yī)院檢驗(yàn)技術(shù)及檢驗(yàn)設(shè)備的不斷完善，樂(lè)山市中醫(yī)院亦分離出大量產(chǎn)ESBLs大腸桿菌。本研究旨在通過(guò)對(duì)樂(lè)山市中醫(yī)醫(yī)院產(chǎn)ESBLs大腸桿菌耐藥性及耐藥基因的檢測(cè)，為臨床用藥治療提供參考。耐藥基因中TEM、SHV和CTX-M基因是ESBLs大腸桿菌中最常見的3個(gè)基因家族，具有極佳的代表性，故選擇這3個(gè)基因進(jìn)行檢測(cè)分析[4]。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2009年2月至2010年5月樂(lè)山市中醫(yī)醫(yī)院收治的門診及住院感染患者256例，所有患者均符合感染診斷標(biāo)準(zhǔn)。從患者的痰液、消化液、血液及切口膿液等部位連續(xù)分離病原菌，并采用美國(guó)BD公司生產(chǎn)的全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定，將其中的大腸桿菌作為研究標(biāo)本進(jìn)行收集。質(zhì)控菌株：大腸桿菌ATCC25922，均購(gòu)自成都生物研究所。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗(yàn) 用頭孢他啶、頭孢噻肟和含克拉維酸的頭孢他啶、頭孢噻肟紙片驗(yàn)證產(chǎn)ESBLs大腸桿菌，用包含頭孢菌素類、碳青酶烯類、喹諾酮類、氨基糖苷類、磺胺類和氯霉素等18種藥敏紙片探討菌株對(duì)臨床常用藥物的耐受情況。采用K-B紙片擴(kuò)散法及全自動(dòng)儀器法，操作和結(jié)果判定按NCCLS標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。中介、敏感在本研究中判定為耐藥[5]。

1.2.2 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)耐藥基因 采用PCR檢測(cè)耐藥基因家族TEM、SHV 和CTX-M，確定分離得到的菌株中含有的基因，初步了解其耐藥的遺傳學(xué)特征。針對(duì)3個(gè)耐藥基因設(shè)計(jì)相應(yīng)的特異性引物，總共設(shè)計(jì)引物3對(duì)；使用商業(yè)化質(zhì)粒提取試劑盒從篩選分離的菌株中提取得到質(zhì)粒作為 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)的模板；利用 PCR 技術(shù)，應(yīng)用設(shè)計(jì)的3對(duì)引物對(duì)每個(gè)模板進(jìn)行檢測(cè)，看菌株中是否存在TEM、SHV 和CTX-M基因。

2 結(jié) 果

2.1 產(chǎn)ESBLs菌株耐藥性 經(jīng)患者的痰液、消化液、血液及切口膿液分離得到大腸桿菌164株，其中產(chǎn)ESBLs 104株。產(chǎn)ESBLs大腸桿菌對(duì)頭孢類抗菌藥物的耐藥率較高，其中頭孢他啶、頭孢拉啶、頭孢噻啶的耐藥率均為100.0%；對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥率較低，且對(duì)亞胺培南、美羅培南的耐藥率均為0，產(chǎn)ESBLs菌株對(duì)常見抗菌藥物的耐藥率明顯高于非產(chǎn)ESBLs菌株的耐藥率(P<0.05)，見表1。

表1 大腸桿菌產(chǎn)ESBLs菌株與非ESBLs菌株耐藥率比較[n(%)]

續(xù)表1 大腸桿菌產(chǎn)ESBLs菌株與非ESBLs菌株耐藥率比較[n(%)]

2.2 產(chǎn)ESBLs菌耐藥基因分型 產(chǎn)ESBLs菌中檢出CTX-M-2型41株(39.5%)、CTX-M-1型30株(28.9%)、SHV型18株(17.3%)和TEM型15株(14.4%)。

3 討 論

ESBLs又稱氧亞氨β-內(nèi)酰胺酶，是指由細(xì)菌質(zhì)粒介導(dǎo)的、能水解甲氧亞氨基β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物如頭孢他啶、頭孢噻肟，以及氨曲南等的一類酶[6-7]。產(chǎn)ESBLs菌可以通過(guò)結(jié)合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)等形成耐藥基因在細(xì)菌間擴(kuò)散，從而造成嚴(yán)重的交叉感染。目前，大腸桿菌、肺炎克雷伯菌是最常見產(chǎn)ESBLs菌株的細(xì)菌。其次，陰溝腸桿菌、黏質(zhì)沙雷氏菌、弗勞地枸櫞酸菌、銅綠假單胞菌也可出現(xiàn)產(chǎn)ESBLs菌株的細(xì)菌。細(xì)菌所產(chǎn)生的重要抗菌藥物滅活酶主要有β-內(nèi)酰胺酶和氨基糖苷類抗菌藥物鈍化酶。β-內(nèi)酰胺酶能裂解青霉素族和頭孢菌素族抗菌藥物的基本結(jié)構(gòu)β-內(nèi)酰胺環(huán)，從而使其喪失抗菌活性。

根據(jù)基因同源性的不同，目前將ESBLs分為5類，即TEM型、SHV型、CTX-M型、OXA型和其他類型如Toho、PER、VEB等基因型。其中CTX-M型又可以分為4組(Ⅰ組包括CTX-M-1、3、10、11、12、15、22、23、28、29、30；Ⅱ組包括CTX-M-2、4、5、6、7、20、Toho-1；Ⅲ組包括CTX-M-8、25、26；Ⅳ組包括CTX-M-9、13、14、16、17、18、19、21、27、Toho-2)。TEM和SHV型是目前世界上大多數(shù)國(guó)家如美國(guó)、英國(guó)、法國(guó)等歐美國(guó)家流行的主要基因型，而我國(guó)則以CTX-M型為主并兼有SHV、TEM型報(bào)道。本組資料中，經(jīng)患者的痰液、消化液、血液及切口膿液等處分離得到大腸桿菌164株，其中產(chǎn)ESBLs 104株。產(chǎn)ESBLs菌中檢出CTX-M-2型41株(39.5%)、CTX-M-1型30株(28.9%)、SHV型18株(17.3%)和TEM型15株(14.4%)。這和國(guó)內(nèi)其他地區(qū)醫(yī)院報(bào)道的耐藥基因型比例類似。產(chǎn)ESBLs大腸桿菌對(duì)頭孢類抗菌藥物的耐藥率較高，其中頭孢他啶、頭孢拉啶、頭孢噻啶的耐藥率均為100.0%；對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥率較低，且對(duì)亞胺培南、美羅培南的耐藥率均為0，產(chǎn)ESBLs菌株對(duì)常見抗菌藥物的耐藥率明顯高于非產(chǎn)ESBLs菌株的耐藥率。這和其他國(guó)內(nèi)學(xué)者報(bào)道的抗菌藥物耐藥性存在較大差異，可能和不同地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平及所使用的抗菌藥物譜存在較大差異有關(guān)。因此，加強(qiáng)對(duì)本地區(qū)本醫(yī)院產(chǎn)ESBLs大腸桿菌耐藥性的認(rèn)識(shí)，采用針對(duì)性的抗菌藥物進(jìn)行治療，才具有實(shí)際意義，其他地區(qū)和醫(yī)院產(chǎn)ESBLs大腸桿菌耐藥情況不能作為本地區(qū)本醫(yī)院用藥參考。

綜上所述，產(chǎn)ESBLs大腸桿菌在感染患者病原菌中占據(jù)一定的比重，其對(duì)常用抗菌藥物的耐藥率明顯高于非產(chǎn)ESBLs大腸桿菌，臨床應(yīng)加強(qiáng)對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的認(rèn)識(shí)，以指導(dǎo)臨床治療。

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四川省教育廳科研項(xiàng)目(13ZB0308)。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.13.051

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1672-9455(2015)13-1935-03

2015-01-22

2015-03-18)