4種放散方法解離免疫球蛋白G抗體效果比較

李 靜，陳保民

(河南省安陽市中心血站 455000)

?

·臨床探討·

4種放散方法解離免疫球蛋白G抗體效果比較

李 靜，陳保民

(河南省安陽市中心血站 455000)

目的 比較乙醚放散、凍融放散、熱放散及枸櫞酸放散4種技術對RhD免疫球蛋白(Ig)G抗體的放散效果。方法 采用乙醚放散、凍融放散、熱放散及枸櫞酸放散4種放散技術分別進行RhD IgG抗體的放散，放散液進行抗體效價測定及統計學分析；將2014年1～5月臨床確診為Rh新生兒溶血病的16例標本分別用4種方法進行放散，比較抗體檢出率及臨床診斷吻合度。結果 不論放散細胞上抗體的致敏性強弱，乙醚放散與枸櫞酸放散解離抗體效果最好，其次是凍融放散，最弱的是熱放散；4種方法的特異性均為100%；敏感性方面，乙醚放散與凍融放散和熱放散比較，t值分別為4.11和9.34，差異有統計學意義(P<0.05)。乙醚放散與枸櫞酸放散比較，t值為0.826，差異無統計學意義(P<0.5)；臨床16例Rh新生兒溶血病標本，乙醚放散與枸櫞酸放散檢出全部抗體，而凍融放散漏檢2例，熱放散漏檢3例。結論 對于RhD IgG抗體的放散，乙醚放散與枸櫞酸放散在特異性、敏感性及準確性方面相似且均優于凍融放散和熱放散。

IgG抗體放散； 乙醚放散； 凍融放散； 熱放散； 枸櫞酸放散

抗體釋放試驗是診斷新生兒溶血病3項試驗中最具有價值的一項試驗。通常ABO血型免疫球蛋白(Ig)M抗體以熱放散法為常用，Rh血型IgG抗體以乙醚放散法為常用[1]。由于乙醚易燃、低毒、麻醉的特殊性，受到公安部門管制。為了能找到一種與乙醚放散效果相接近的放散技術，本文選擇了凍融放散、熱放散及枸櫞酸放散3種放散技術與乙醚放散進行RhD IgG抗體的放散效果比較，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年1～5月臨床確診為Rh新生兒溶血病的16例標本。

1.2 儀器與試劑 普通離心機(TDZ4-WS，湖南賽特湘儀)；細胞洗滌離心機(KA-2200，日本久保田)；37 ℃、56 ℃水浴箱(HH-600，蘇州威爾)；4 ℃藥用冷藏柜[MPR-312D(CN)-C，大連三洋]；-30 ℃低溫保存箱(MDF-U338-C，大連三洋)；快速混勻器(SK-1，蘇州金壇)；酸度計(PHS-25，上海虹益)；IgG抗-D(20130930，上海血液生物醫藥公司)；生理鹽水(20130923，山東華魯制藥公司)；無水乙醚；O細胞(201545303，上海血液生物醫藥公司)；多特異性抗人球蛋白試劑(20130904，上海血液生物醫藥公司)；枸櫞酸(20131016，天津天力)；磷酸三鉀(20130320，天津科密歐)；HCL(130406，開封開化)；磷酸三鈉(20110103，天津天力)。

1.3 方法

1.3.1 致敏紅細胞的制備 隨機抽取O型RhD陽性無償獻血紅細胞標本10份混勻，經洗滌后制成壓積紅細胞，分成3份備用。取兩份壓積紅細胞分別與IgG抗-D試劑以1∶1、1∶3比例混勻，置37 ℃水浴10 min后再次洗滌至少6次制成致敏壓積紅細胞。最后一次洗滌時的上清液與相應細胞反應為陰性，且致敏紅細胞做直抗試驗結果為1∶1比例凝集度小于或等于2+、1∶3比例凝集度大于3+方為合格。

1.3.2 陰性對照紅細胞的制備 將1.3.1步驟中剩余的一份洗滌壓積紅細胞做直抗試驗，結果為陰性即可作為陰性對照紅細胞。

1.3.3 乙醚放散和熱放散試驗 取適量致敏壓積紅細胞與陰性對照紅細胞按照《免疫血液學》[2]第十二章“放散試驗”方法平行放散5次，放散液進行IgG抗體效價測定。

1.3.4 凍融放散和枸櫞酸放散試驗 取適量致敏壓積紅細胞與陰性對照紅細胞按照《實用血液免疫學血型理論和實驗技術》[3]第三十章“吸收放散試驗”方法平行放散5次，放散液進行IgG抗體效價測定。

1.3.5 將16例標本分別用4種方法進行放散，比較4種方法的抗體檢出率。

1.4 統計學處理 使用SPSS19.0統計學軟件。計數資料以率表示，比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 將凝集強度為強陽性(>3+)和弱陽性(≤2+)的致敏壓積紅細胞及陰性對照紅細胞分別用4種方法進行放散。陰性對照紅細胞放散結果為陰性，強陽性和弱陽性的致敏壓積紅細胞均放散出抗體。放散液IgG抗體效價測定及紅細胞凝集強度積分結果見表1。

表1 4種放散方法IgG抗體效價及凝集強度積分結果

2.2 4種放散方法敏感性及特異性比較 4種放散方法所得放散液中IgG抗體的平均凝集積分見表2。表明4種放散技術放散IgG抗體的特異性均為100%；就敏感性而言，不論致敏紅細胞的凝集度強弱，乙醚放散與枸櫞酸放散比較;乙醚放散與凍融放散和放散比較，t值為0.826，差異無統計學意義(P>0.05)，且均明顯高于凍融放散和熱放散，t值分別為4.11和9.34，差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 4種放散方法放散液中抗體效價平均積分比較(分)

2.3 16例臨床標本4種放散方法的檢測結果 乙醚放散與枸櫞酸放散16例陽性標本的檢出率為100.0%，而凍融放散漏檢2例，熱放散漏檢3例。見表3。

2.4 4種方法放散過程中壓積紅細胞及放散液狀態 凍融放散所需的壓積紅細胞量最多，但所得放散液最少。而對于放散液狀態，乙醚放散、凍融放散的放散液顏色暗紅、渾濁、不透明；加熱放散的放散液雖為櫻紅色，但透明度仍不高；枸櫞酸放散的放散液狀態最好，為極淺透明紅色。見表4。

表3 16例臨床標本4種放散方法的檢測結果

表4 4種方法放散過程中壓積紅細胞及放散液狀態比較

3 討 論

實驗室用于抗體放散的方法主要有熱放散法、凍融放散法、超聲放散法、微波放散法等物理方法，也有乙醚法、枸櫞酸法、氯仿法、二氯甲烷法、三氯乙烯-三氯甲烷法、磷酸氯喹法等化學方法[4-5]。其中氯仿法是一種能同時放散IgG和IgM抗體的試驗方法，很早便被美國血庫協會的工具書列為常規方法，但氯仿在使抗體解離的同時會使紅細胞本身蛋白質嚴重變性[6]，同時含氯試劑有毒，容易造成人員和環境污染；超聲放散法和微波放散法操作時需要特殊儀器；對于磷酸氯喹放散法，試劑易殘留，影響試驗結果。所以本文選擇了兩種物理放散法(熱放散、凍融放散)和兩種化學放散法(乙醚放散、枸櫞酸放散)進行放散效果的比較。

根據表1可以看出，不論放散細胞上抗體的致敏性強弱，乙醚放散與枸櫞酸放散的放散效果最好，其次是凍融放散，最弱的是熱放散。經過計算放散液中IgG抗體的平均凝集積分，4種方法放散IgG抗體的特異性均為100%；但就敏感性而言，乙醚放散與凍融放散和熱放散比較，t值分別為4.11和9.34，差異有統計學意義(P<0.05)。乙醚放散與枸櫞酸放散比較，t值為0.826，且均明顯高于凍融放散和熱放散技術，差異無統計學意義(P>0.5)。為了驗證試驗結果，將臨床確診為Rh新生兒溶血病的16例標本分別用4種方法進行抗體放散，結果乙醚放散與枸櫞酸放散的抗體檢出率均為100.00%，而凍融放散漏檢2例，熱放散漏檢3例。鄭凌等[7]也對臨床患者紅細胞熱放散與酸放散的檢測結果進行了比較，顯示熱放散的放散效果明顯差于酸放散。

比較4種方法放散過程中壓積紅細胞及放散液狀態可以看出，由于乙醚放散、凍融放散和熱放散中的放散細胞均受到了不同程度的破壞，造成放散液透明度不高，影響鹽水、酶法及凝聚胺一步法試驗結果的觀察。而且凍融放散所需紅細胞較多，如果放散液需要進行抗體鑒定，需要大量的紅細胞才能滿足試驗需求。枸櫞酸放散的原理是解離紅細胞膜上致敏的IgG抗體對紅細胞進行抗原鑒定，因此紅細胞膜破壞程度輕，放散后的紅細胞還可進行其他試驗，所得放散液量多且清澈，不影響各種方法凝集試驗結果的直接觀察。但值得注意的是該方法需在進行振搖前才能加入枸櫞酸溶液，加入時間過長會使紅細胞溶血。同時，該方法可破壞Kell系統抗原，放散后的細胞不能進行Kell系統定型實驗。

對于RhD IgG抗體的放散，乙醚放散與枸櫞酸放散在特異性、敏感性及準確性方面相接近，且均優于凍融放散和熱放散。但作為兩種物理放散方法，凍融放散和熱放散制備抗體最容易。因此，在臨床實踐中應根據具體情況選擇適合的方法，才能得到理想的結果。

[1]中華人民共和國衛生部醫政司．全國臨床檢驗操作規程[M]． 3版．南京：東南大學出版社，2006：256．

[2]丁蘇鄂．常用血清學檢查技術[C].上海：上海科學技術出版社，2002：222．

[3]童軍，劉慶海，楊文沖．血型血清學實驗方法[C].北京：科學出版社，2006：631-632．

[4]鄭凌，劉衍春，吳敏慧，等．甘氨酸-HCl/EDTA酸放散法在AIHA標本配血中的應用[J]．中國輸血雜志，2013，26(10)：1005-1007．

[5]安萬新，于衛建．輸血技術學[M]．北京：科學技術文獻出版社，2006：277．

[6]孫愛農，鮑自謙，查勇．解離紅細胞致敏抗體的3種方法比較[J]．中國輸血雜志，2004，17(1)：17-19．

[7]鄭凌，劉衍春，吳敏慧.甘氨酸-HCL/EDTA酸放散法在A2HA標本配血中的應用[J].中國輸血雜志，2013,26(10)：1005-1007.

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.13.058

A

1672-9455(2015)13-1947-03

2015-01-20

2015-03-12)