人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定

韓 華，薛 改，張俊勤，閆 萍，李艷麗

（1.河北省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北石家莊050051；2.中國(guó)人民解放軍白求恩國(guó)際和平醫(yī)院藥劑科，河北石家莊050082；3.中國(guó)人民解放軍第二六○醫(yī)院病理科，河北石家莊050041）

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定

韓 華1，薛 改2，張俊勤1，閆 萍1，李艷麗3

（1.河北省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北石家莊050051；2.中國(guó)人民解放軍白求恩國(guó)際和平醫(yī)院藥劑科，河北石家莊050082；3.中國(guó)人民解放軍第二六○醫(yī)院病理科，河北石家莊050041）

目的 探討人臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)、鑒定及凍存、復(fù)蘇的方法。方法 收集健康足月新生兒臍帶組織，采用組織塊貼壁法分離、培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原，將細(xì)胞凍存3個(gè)月后復(fù)蘇，鑒定復(fù)蘇后細(xì)胞的特性。結(jié)果 組織塊貼壁法獲得臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成功率高；細(xì)胞表面高表達(dá)CD29、CD44、CD90和CD105，不表達(dá)造血干細(xì)胞表型CD34、CD45等；凍存后再?gòu)?fù)蘇細(xì)胞活性高達(dá)80%～90%。結(jié)論 組織塊貼壁法可以從人臍帶華通膠中較好的分離、培養(yǎng)出間充質(zhì)干細(xì)胞，為干細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)研究和臨床治療提供了理想的細(xì)胞來源。

臍帶；間充質(zhì)干細(xì)胞；胎血

干細(xì)胞是一群具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞，根據(jù)發(fā)育狀態(tài)可以分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。其中間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一類具有高度自我更新和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，在體外可以分化誘導(dǎo)為骨、脂肪、神經(jīng)等多種組織細(xì)胞［1－3］，具有向受損組織歸巢并且修復(fù)、重建受損或病變組織器官的特點(diǎn)。此外，MSCs還具備免疫原性低、移植成活率高、細(xì)胞治療效果好等特點(diǎn)，因此成為當(dāng)前干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)。目前臨床應(yīng)用MSCs的主要來源為骨髓、臍帶血［4］，但成人骨髓中MSCs數(shù)量較少，病毒感染率高，免疫原性強(qiáng)，且取材較復(fù)雜，限制其應(yīng)用［5］。從臍帶血中獲取MSCs成功率較低，分離數(shù)量較少，易受干擾，影響了其臨床應(yīng)用。近年研究顯示，人臍帶中存在大量的MSCs，與其他來源相比，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（umbilical cord mesencymal stem cells，UC-MSCs）更加易于獲得，對(duì)母子均無損傷，且凍存和復(fù)蘇后細(xì)胞的生物學(xué)性狀無明顯變化［6］，使其成為細(xì)胞治療中的理想細(xì)胞而逐漸替代骨髓來源MSCs。本實(shí)驗(yàn)主要研究人UC-MSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定，以及細(xì)胞的凍存、復(fù)蘇，旨在為下一步進(jìn)行細(xì)胞移植治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臍帶標(biāo)本 取自河北省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，均為正常足月剖宮產(chǎn)新生兒臍帶，共10根，排除母兒各種傳染性疾病及家族遺傳病，獲得產(chǎn)婦及家屬知情同意。

1.1.2 主要試劑及儀器 DMEM／F12培養(yǎng)液、胎牛血清（fetal calf serum，F(xiàn)BS）、胰蛋白酶／EDTA消化液、CD29-PE、CD44-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD34-PE、CD45-FITC、人白細(xì)胞DR抗原-FITC、超凈工作臺(tái)、OLYMPUS倒置顯微鏡、流式細(xì)胞儀、培養(yǎng)箱、離心機(jī)、無菌培養(yǎng)瓶等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 UC-MSCs的提取及培養(yǎng) 無菌取剖宮產(chǎn)新鮮臍帶約10 cm，生理鹽水洗去臍帶殘留血液，剪成2～3 cm的小段，再次漂洗，縱行剖開臍帶，剔除1條臍靜脈、兩條臍動(dòng)脈，剝離華通膠。用眼科剪將華通膠剪碎成1 mm3的小組織塊，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入含有體積分?jǐn)?shù)為10%FBS、100 U／m L青霉素、100 mg／L鏈霉素的DMEM／F12培養(yǎng)液，于5% CO2、37℃的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。倒置顯微鏡每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。1周后首次換液，此后3～4 d換液1次。待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)用胰蛋白酶／EDTA消化液消化傳代，顯微鏡下控制消化時(shí)間。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物 分別取原代、第3代、第6代、第9代細(xì)胞，達(dá)到80%～90%融合時(shí)用胰蛋白酶／EDTA消化液消化，制成1× 106／m L細(xì)胞懸液。分別加入鼠抗人單克隆抗體CD29-PE、CD44-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD34-PE、CD45-FITC各10μL，充分混勻，室溫下反應(yīng)30 min，每管加入1.5 m L PBS，1 200 r／min離心5 min，棄上清，每管加入100μL PBS，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.3 UC-MSCs的凍存及復(fù)蘇 收集第三代剛?cè)诤系腢C-MSCs，胰酶消化細(xì)胞，離心5 min，離心后以FBS配制的10%二甲基亞砜重懸細(xì)胞，置入－80℃冰箱，第2天轉(zhuǎn)入液氮中保存。凍存3個(gè)月后復(fù)蘇細(xì)胞，從液氮中取出凍存管，將細(xì)胞直接放入37℃水浴箱中融化，PBS洗滌2遍，置入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞傳代至第3代時(shí)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)鑒定，方法同前。

2 結(jié) 果

2.1 UC-MSCs的形態(tài)學(xué)觀察 成功從臍帶組織中分離出華通膠，經(jīng)培養(yǎng)后用倒置顯微鏡觀察。接種后1～2 d組織塊開始貼壁，7 d后可見部分細(xì)胞從組織塊周圍爬出，形態(tài)呈梭形、紡錘形，局部可成集落生長(zhǎng)，14 d左右細(xì)胞形成片狀融合達(dá)80%，呈旋渦狀生長(zhǎng)，即可進(jìn)行1∶3傳代。傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)能力明顯增強(qiáng)，細(xì)胞呈現(xiàn)均一的長(zhǎng)梭形，類似成纖維細(xì)胞，成典型的旋渦狀排列生長(zhǎng)。細(xì)胞在增殖傳代過程中形態(tài)無明顯變化。

2.2 UC-MSCs的表面標(biāo)志物測(cè)定 流式細(xì)胞儀檢測(cè)UC-MSCs免疫表型，結(jié)果顯示，原代培養(yǎng)的UCMSCs已經(jīng)開始高表達(dá)CD44、CD90、CD105，但仍表達(dá)一定程度的CD34、CD45，而第3代UC-MSCs高度表達(dá)CD29、CD44、CD90、CD105等間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志，幾乎不表達(dá)CD34、CD45等造血細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志和主要組織相容性抗原人白細(xì)胞DR抗原。2.3 UC-MSCs的凍存、復(fù)蘇 凍存3個(gè)月后再?gòu)?fù)蘇，鏡下可見細(xì)胞飽滿，邊緣整齊，形態(tài)完整，細(xì)胞活力為80%～90%，傳代生長(zhǎng)良好，與凍存前基本一致。復(fù)蘇后的細(xì)胞傳至第3代時(shí)，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，其表面標(biāo)志物測(cè)定結(jié)果與未凍存的UC-MSCs相似。

3 討 論

目前，干細(xì)胞的研究逐漸成為現(xiàn)階段的熱點(diǎn)。MSCs是來源于中胚層間充質(zhì)的成體干細(xì)胞，主要存在于骨髓、臍血、臍帶、外周血等組織中，最早從骨髓中分離得到。但骨髓MSCs取材較困難，污染率高，且隨著年齡老化細(xì)胞數(shù)量和分化能力相對(duì)減少和減弱［7－8］，因而限制其臨床應(yīng)用。與其相比，人臍帶組織作為“醫(yī)療廢物”，從中提取MSCs取材方便，不存在倫理問題，且細(xì)胞含量高、增殖能力強(qiáng)、免疫原性低，越來越受到研究者的關(guān)注。

正常臍帶是連接胎兒臍部與胎盤之間的索狀結(jié)構(gòu)，表面被覆羊膜［9］，內(nèi)含2條臍動(dòng)脈和1條臍靜脈。在臍血管周圍有黏蛋白樣組織包裹，稱為臍帶華通膠，其富含大量的間充質(zhì)干細(xì)胞、膠原纖維、透明質(zhì)酸等［10］。目前，從人臍帶華通膠中分離和培養(yǎng)MSCs的方法主要有酶消化法和組織塊貼壁法。酶消化法操作復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，技術(shù)要求高，對(duì)細(xì)胞機(jī)械損傷和化學(xué)污染較重。因而，本實(shí)驗(yàn)采用組織塊貼壁法分離培養(yǎng)MSCs，結(jié)果顯示組織塊在培養(yǎng)7 d左右即有細(xì)胞爬出，細(xì)胞呈典型的紡錘形，增殖較快，14 d左右細(xì)胞呈漩渦狀生長(zhǎng)，傳代后細(xì)胞形態(tài)以梭形纖維樣細(xì)胞為主，呈漩渦樣生長(zhǎng)，生長(zhǎng)能力增強(qiáng)。這表明MSCs可以在短時(shí)間內(nèi)貼壁、快速生長(zhǎng)，培養(yǎng)的細(xì)胞可穩(wěn)定傳代，細(xì)胞形態(tài)與增殖能力沒有明顯改變，與國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道基本一致［11］。

既往研究［12－13］表明，MSCs尚無特異性膜表面相關(guān)抗原，但成熟MSCs能夠高表達(dá)CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106等膜表面標(biāo)記物，不表達(dá)CD14、CD34、CD45等造血干細(xì)胞標(biāo)志抗原。本實(shí)驗(yàn)選取了報(bào)道較多的細(xì)胞表面標(biāo)記物，應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示UC-MSCs高度表達(dá)CD29、CD44、CD90、CD105，幾乎不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志物，與骨髓來源MSCs具有相似的免疫表型，同以往研究結(jié)果一致。此外，組織相容性抗原人白細(xì)胞DR抗原的低表達(dá)可以證明UC-MSCs免疫原性弱，不會(huì)引起排斥反應(yīng)，異體移植幾乎不受影響。

UC-MSCs的凍存和復(fù)蘇具有重要的臨床價(jià)值，需要嫻熟的技術(shù)和嚴(yán)格的管理，以便很好地保證經(jīng)分離、凍存、復(fù)蘇后的UC-MSCs在臨床使用過程中的安全性和有效性。本研究結(jié)果顯示，在UCMSCs凍存復(fù)蘇過程中，細(xì)胞活性及生長(zhǎng)速度沒有受到明顯影響，復(fù)蘇后的細(xì)胞形態(tài)、特性及表面標(biāo)記物測(cè)定同凍存前基本一致，為建立UC-MSCs庫(kù)提供了初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

綜上所述，組織塊貼壁法分離培養(yǎng)UC-MSCs是一種簡(jiǎn)便易行、穩(wěn)定成熟的細(xì)胞培養(yǎng)方法。UCMSCs以其來源豐富、取材簡(jiǎn)單、擴(kuò)增迅速、細(xì)胞數(shù)量多、免疫原性低等獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為組織再生醫(yī)學(xué)中最有潛力的種子細(xì)胞，給進(jìn)一步進(jìn)行干細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)研究和臨床治療帶來了廣闊的前景［14］。

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（本文編輯：劉斯靜）

Isolation，culture and identification of human umbilical cord mesenchymal stem cells

HAN Hua1，XUE Gai2，ZHANG Jun-qin1，YAN Ping1，LI Yan-li3
（1.Department of Obstetrics and Gynecology，Hebei General Hospital，Shijiazhuang 050051，China；2.Department of Pharmacology，Bethune International Peace Hospital，Shijiazhuan g 050082，China；3.Department of Pathology，PLA 260 Hospital，Shijiazhuan g 050041，China）

ObjectiveTo explore isolating，culturing，identifying，freezing and thawing mesenchymal stem cells（MSCs）approach from Wharton jelly of human umbilical cord.MethodsThe MSCs were isolated from neonate umbilical cord，cultured by tissue explants adherent method.The surface markers were identified by flow cytometry.Passage cells，frozen 6 months，were thawed，then their biological characteristics were identified.ResultsMSCs were easily obtained from Wharton jelly of human umbilical cord via the proposed approach of tissue adherence.The flow cytometry analysis showed that MSCs expressed CD29，CD44，CD90 and CD105 positively，but negatively for CD34，CD45.The living cells of MSCs were 80%－90%after having been frozen and the thawed cells had the same characteristics as the previous.ConclusionMSCs can be successfully isolated from Wharton jelly of human umbilical cord by this method.The stem cells derived from Wharton jelly of human umbilical cord may be a novel alternative source of human MSCs for experimental and clinical applications.

umbilical cord；mesenchyma stem cells；fetal blood

R394.2

A

1007-3205（2015）01-0021-03

2014－07－22；

2014－09－20

韓華（1982－），女，河北邯鄲人，河北省人民醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事婦產(chǎn)科疾病診治研究。

10.3969／j.issn.1007-3205.2015.01.008