內皮祖細胞在缺血性疾病治療中的臨床應用

孫麗娜，高海娜(綜述)，陳樹春(審校)

(1.河北醫科大學研究生學院，河北石家莊050017;2.河北省人民醫院內分泌一科，河北石家莊050051)

內皮祖細胞在缺血性疾病治療中的臨床應用

孫麗娜1，高海娜1(綜述)，陳樹春2(審校)

(1.河北醫科大學研究生學院，河北石家莊050017;2.河北省人民醫院內分泌一科，河北石家莊050051)

造血干細胞;缺血;綜述文獻

內皮祖細胞(endothelail progenitor cells，EPCs)是Asahara在1997年首次從成人外周血中分離得到的具有分化為內皮細胞潛能并參與新血管形成的祖細胞［1］。傳統意義上來講，出生后的新血管形成指原位內皮細胞的增殖和遷移，進而形成新的血管網。而EPCs能夠歸巢到新血管形成部位并分化為內皮細胞，在出生后新血管形成中發揮重要作用［2］。因此，EPCs的發現徹底改變了人們對出生后血管形成的理解，為缺血性疾病臨床治療提供了新的策略。目前，有關EPCs在人體缺血性疾病治療中安全性和有效性的研究也已經開展。現就EPCs移植在缺血性疾病治療中存在的問題以及應用前景綜述如下。

1 EPCs生物學特性

自Asahara于1997年首次描述EPCs后，EPCs尚缺乏一個明確的定義，尤其是其表面特異性抗原標志仍存在較大爭議。目前較認可的EPCs表面特異性抗原標志包括CD34、血管內皮生長因子受體2 (vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR2)和AC133［3］。CD34分子是高度糖基化的i型跨膜蛋白，選擇性地表達于造血干細胞/祖細胞表面，是篩選造血干細胞/祖細胞的主要標準。VEGFR2是血管系統的抗原標志，是胚胎期血液、血管發生的關鍵受體。AC133是一種新的造血干細胞/祖細胞標志物，AC133+細胞具有內皮細胞特性。用血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和干細胞生長因子(stem cell growth factor，SCGF)刺激培養的AC133+，大多數細胞表現出內皮特性，包括VEGFR2、荊豆凝集素1和血管假性血友病因子。研究發現隨著EPCs向成熟內皮細胞的分化，AC133表達逐漸下降直至陰性［4］。

目前EPCs分為2種類型，即早期EPCs和晚期EPCs。雖然早期 EPCs和晚期 EPCs共同表達CD34、VEGFR2等表面標志物，但兩者在細胞形態、增殖功能和成管功能方面存在很大差異［5］。早期EPCs呈紡錘狀，增殖能力低，幾乎沒有成管功能，卻能夠大量釋放血管生成因子。晚期EPCs呈鵝卵石狀，增殖能力旺盛，成管功能強大。基于2種EPCs的差異，有研究者認為早期EPCs遷移到缺血部位后，通過分泌血管生成因子招募循環內皮細胞促進血管形成，而晚期EPCs直接參與新血管的形成過程。雖然2類EPCs的生物學特性差異很大，但其在促進血管新生方面都發揮重要作用。

2 EPCs在出生后血管新生中的作用

2.1 EPCs直接促進新血管形成的作用 血管形成包括原位內皮遷移、增殖和分化的從頭形成過程以及骨髓來源的EPCs參與的血管再生［2］。目前有一種較成熟的動物模型證明EPCs直接促進新血管形成作用，該模型用內皮細胞系特異性啟動因子諸如VEGFR2和促血管生成素受體等刺激轉基因小鼠，轉基因小鼠表達半乳糖苷酶基因，將這種轉基因小鼠的骨髓細胞移植到野生型小鼠體內，野生型小鼠的EPCs將成為治療不同缺血性疾病的細胞基礎。利用這一模型已經證明骨髓來源EPCs參與腫瘤生長、創傷愈合、骨骼肌和心肌缺血以及激素調節的子宮內膜修復過程中局部血管形成［2，6］。毫無疑問，EPCs在缺血組織血管形成的過程中發揮重要作用。

2.2 EPCs間接促進新血管生成的作用 目前新的研究［7］顯示EPCs不僅直接參與新血管形成，而且能夠分泌一系列血管生成因子和生長因子，促進已有內皮細胞的增殖和遷移，激活血管生成，間接發揮促進血管生成和維持組織穩態的功能。有臨床前期研究［8］證明在心肌缺血模型中，移植的EPCs分泌的外在因子能夠增強移植受體內在的血管形成。研究［9］發現EPCs能夠分泌多種血管生成因子，包括VEGF、血小板衍生生長因子和成纖維細胞生長因子。因此，EPCs不僅能夠直接促進血管生成，同時也可以通過分泌細胞因子激活血管形成過程中原位內皮細胞的增殖和遷移，進而促進缺血組織血管新生而發揮組織保護作用，調節血管形成過程。

3 EPCs移植為基礎的血管生成治療

3.1 EPCs移植的動物實驗 動物實驗已經證明在沒有其他促進血管生成因子的條件下，移植的EPCs能夠有效促進缺血組織的新血管形成和血管再生。Kalka等［10］首次將體外擴增培養的人外周血來源的EPCs移植到免疫缺陷小鼠的缺血后肢，發現移植的EPCs能夠促進小鼠缺血后肢的新血管形成。Tanaka等［11］采用質量與數量控制培養系統體外擴增培養EPCs 7 d后，移植到鏈脲霉素誘導的Ⅰ型糖尿病小鼠體內，小鼠新血管形成和切口愈合能力均高于對照組，證明EPCs移植治療能夠改善切口愈合。

此外，CD34是EPCs的主要細胞標志，有研究認為 CD34+細胞可能與 EPCs有同樣的治療意義［12］。缺血心肌左室功能恢復程度以及新血管形成與移植的 CD34+細胞含量呈濃度依賴。Elsharawy等［13］采用鏈脲霉素腹膜內注射誘導Ⅰ型糖尿病大鼠模型，并在大鼠右前肢造貫穿皮膚全層直徑10 mm的切口，治療組注射人臍靜脈來源CD34+細胞，經過2周時間，與對照組相比，CD34+細胞治療組創傷面積明顯下降，表皮平均厚度、新血管形成數量、膠原沉積均高于對照組。CD34+細胞促進血管新生的作用從另一方面體現了EPCs潛在治療價值。

3.2 EPCs移植的臨床研究 基于動物實驗的研究結果，目前一些Ⅰ、Ⅱ期臨床研究開始觀察EPCs治療缺血性疾病的臨床效果，以期得到與動物實驗相同的結果。

研究［14］發現EPCs移植治療能夠提高心室射血分數，減少心臟缺血面積并改善心肌的血流灌注。Beeres等［15］研究證明接受EPCs移植治療的患者心血管癥狀明顯改善，運動耐力增加。同樣，CD34+細胞移植治療的臨床實驗也得到相類似的結果。Losordo等［16］進行了一項多中心的隨機雙盲對照臨床試驗，觀察自體CD34+細胞經集落刺激因子(G-colony stimulating factor，G-CSF)刺激后治療肢體缺血性疾病的安全性和有效性，選取了28例患有輕微肢體缺血性疾病患者和已經失去手術治療機會或經皮血管成形術治療的嚴重肢體缺血性疾病患者，隨機分為低劑量治療組(1×105CD34+/kg，n=7)，高劑量治療組(1×106CD34+/kg，n=9)和安慰劑對照組(n=12)。安全性評價包括不良反應、生命體征測量和基本實驗室檢查結果(生化檢查、血常規、心臟標志物和尿常規)。有效性評價指標包括隨訪12個月內的患肢保留、疼痛評分、6 min步行試驗、切口面積評估和生活質量評價。經過12個月的隨訪觀察，受試者既沒有出現死亡現象，也沒有出現威脅生命的不良反應，接受CD34+細胞注射治療組截肢率低于對照組，且高劑量治療組較低劑量組有下降趨勢。這項研究為EPCs移植治療Ⅲ期臨床研究提供了有力證據［16］。

EPCs移植的治療效果受到很多因素的影響，如年齡、糖尿病、高三酰甘油血癥、高血壓和吸煙都是EPCs移植成功與否的限制因素。事實上，大部分進行EPCs移植治療的患者可能都有上述疾病病史。因此，人們在不斷尋求新的方法克服EPCs移植治療過程中的問題:①細胞或生長因子刺激后促進內源性EPCs的動員［17］;②通過平滑肌祖細胞、間充質干細胞等細胞系的共同移植增強EPCs功能［3］;③基因轉染技術增強EPCs的功能［18］;④通過細胞培養技術擴增EPCs［19］。這些方法可能彌補目前EPCs應用于缺血性疾病臨床移植治療中的不足。

綜上所述，骨髓來源的EPCs有促進出生后血管形成的潛能，為缺血性疾病開辟了新的治療方法。但由于EPCs缺乏特異的表面標記，難以從循環血中獲得足夠數量的自體EPCs，EPCs的分離與純化都存在一定難度，使得EPCs大規模應用于臨床治療受到限制。為了實現EPCs為基礎的細胞移植治療，尋求一種可行的分離和擴增EPCs的方法仍是這一領域未解決的關鍵問題。

［1］Asahara T，Murohara T，Sullivan A，et al.Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis［J］.Science，1997，275(5302):964-967.

［2］Asahara T，Masuda H，Takahashi T，et al.Bone marrow origin of endothelial progenitor cells responsible for postnatal vasculogenesis in physiological and pathological neovascularization［J］.Cir Res，1999，85(3):221-228.

［3］Sen S，Mcdonald SP，Coates PT，et al.Endothelial progenitor cells:novel biomarker and promising cell therapy for cardiovascular disease［J］.Clin Sci(Lond)，2011，120(7): 263-283.

［4］Salven P，Mustjoki S，Alitalo R，et al.VEGFR-3 and CD133 identify a population of CD34+lymphatic/vascular endothelial precursor cells［J］.Blood，2003，101(1):168-172.

［5］Cheng CC，Chang SJ，Chueh YN，et al.Distinct angiogenesis roles and surfacemarkers of early and late endothelial progenitor cells revealed by functional group analyses［J］.BMCGenomics，2013，14:182.

［6］Masuda H，Kalka C，Takahashi T，et al.Estrogen-mediated endothelial progenitor cell biology and kinetics for physiologicalpostnatal vasculogenesis［J］.Cir Res，2007，101(6):598-606.

［7］Seebach C，Henrich D，Wilhelm K，et al.Endothelial progenitor cells improve directly and indirectly early vascularization of mesenchymal stem cell-driven bone regeneration in a criticalbone defect in rats［J］.Cell Transplant，2012，21(8):1667-1677.

［8］Urbich C，Aicher A，Heeschen C，etal.Soluble factors released by endothelial progenitor cells promotemigration of endothelial cells and cardiac resident progenitor cells［J］.JMol Cell Cardiol，2005，39(5):733-742.

［9］Rosell A，Morancho A，Navarro-Sobrino M，et al.Factors secreted by endothelial progenitor cells enhance neurorepair responses after cerebral ischemia in mice［J］.PloSOne，2013，8(9):e73244.

［10］Kalka C，Masuda H，Takahashi T，et al.Transplantation of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2000，97(7): 3422-3427.

［11］Tanaka R，Vaynrub M，Masuda H，et al.Quality-control culture system restores diabetic endothelial progenitor cell vasculogenesis and accelerates wound closure［J］.Diabetes，2013，62(9):3207 -3217.

［12］Iwasaki H，Kawamoto A，Ishikawa M，et al.Dose-dependent contribution of CD34-positive cell transplantation to concurrent vasculogenesis and cardiomyogenesis for functional regenerative recovery after myocardial infarction［J］.Circulation，2006，113 (10):1311-1325.

［13］Elsharawy MA，Naim M，Greish S.Human CD34+stem cells promote healing of diabetic foot ulcers in rats［J］.Interact Cardiovasc Thorac Surg，2012，14(3):288-293.

［14］Jujo K，Ii M，Losordo DW.Endothelial progenitor cells in neovascularization of infarcted myocardium［J］.J Mol Cell Cardiol，2008，45(4):530-544.

［15］Beeres SL，Lamb HJ，Roes SD，et al.Effect of intramyocardial bone marrow cell injection on diastolic function in patients with chronic myocardial ischemia［J］.JMagn Reson Imaging，2008，27 (5):992-997.

［16］Losordo DW，Kibbe MR，Mendelsohn F，et al.A randomized，controlled pilot study of autologous CD34+cell therapy for critical limb ischemia［J］.Circ Cardiovasc Interv，2012，5(6):821-831.

［17］Powell TM，Paul JD，Hill JM，et al.Granulocyte colony-stimulating factor mobilizes functional endothelial progenitor cells in patients with coronary artery disease［J］.Arterioscier Thromb Vasc Biol，2005，25(2):296-301.

［18］Yang HN，Park JS，Woo DG，et al.Transfection of VEGF165 genes into endothelial progenitor cells and in vivo imaging using quantum dots in an ischemia hind limb model［J］.Biomaterials，2012，33(33):8670-8684.

［19］Bueno-Beti C，Novella S，Lazaro-Franco M，et al.An affordable method to obtain cultured endothelial cells from peripheral blood［J］.J Cell Mol Med，2013，17(11):1475-1483.

(本文編輯:劉斯靜)

R543

A

1007-3205(2015)02-0234-03

2014-04-23;

2014-05-25

孫麗娜(1988-)，女，河北張家口人，河北省人民醫院醫學碩士研究生，從事內分泌與代謝疾病診治研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2015.02.042