16S rDNA PCR-RFLP分析鑒定開菲爾發酵劑中的乳酸菌

李 佳，李 艷,2，牟德華,*

（1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018；2.河北省發酵工程技術研究中心，河北 石家莊 050018）

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16S rDNA PCR-RFLP分析鑒定開菲爾發酵劑中的乳酸菌

李 佳1，李 艷1,2，牟德華1,*

（1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018；2.河北省發酵工程技術研究中心，河北 石家莊 050018）

摘 要：對傳統乳制品開菲爾發酵劑通過菌種分離和純化得到67 株乳酸菌，經過傳統形態學分類區分成6 種形態類型。在此基礎上進行16S rDNA限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）分析法鑒定為4 種分子類型，分別為：乳明串株菌（L. lactis）、堅強腸球菌（E. durans）、意大利腸球菌（E. italicus）、嗜熱鏈球菌（S. thermophilus）。其中堅強腸球菌菌數超過50%，占所分離菌株的62.7%，為優勢菌。

關鍵詞：開菲爾發酵劑；乳酸菌；16S rDNA PCR-RFLP

開菲爾（Kefir）是一種發酵乳，起源于俄羅斯北高加索地區，與普通酸奶不同，它是由數10 種乳酸菌及酵母菌所形成的復合型發酵劑開菲爾粒發酵形成的復合型發酵乳，是復雜微生物的共生體[1-2]。開菲爾能改善消化機能，提高鈣的利用率，對腸道疾病、高血壓、心臟病、腦血栓、心肌梗塞等有預防和緩解作用[3-4]。開菲爾發酵劑包括開菲爾粒和開菲爾發酵液。農牧民長期把牛奶裝在羊皮口袋內，經過自然發酵而形成不規則的乳白色或淺黃色顆粒狀物，稱為開菲爾粒[5]，開菲爾發酵液是利用開菲爾粒在牛奶中生長而獲得的發酵液。開菲爾發酵劑中含有多種益生微生物，包括多種乳酸菌和酵母菌。在發酵乳制品的生產過程中，只能使用增殖后的牛奶作為新的發酵劑，這種傳統的傳代方式使開菲爾發酵劑極不穩定，容易造成雜菌的污染[6]，限制了傳統開菲爾發酵乳制品的工業化生產，以及新型動物性和植物性發酵乳產品的開發。因此篩選優良性能的乳酸菌，并開發研制具有自主知識產權的發酵劑，對我國發酵乳制品工業的發展有重要意義。

目前，乳酸菌的分子鑒定廣泛采用16S rDNA 限制性內切酶片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）分析技術[7-8]，或與其他鑒定技術結合進行乳酸菌鑒定。16S rDNA具有保守性和高變性，RFLP技術是用不同的限制性內切酶對細胞基因組DNA進行酶切，然后進行電泳分析用于對比不同基因組件的核苷酸差異。16S rDNA聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術與RFLP技術結合，可以把乳酸菌鑒定到種水平[9]。本研究從開菲爾粒和開菲爾發酵液中分離篩選乳酸菌，并進行傳統的形態分類和分子生物學鑒定，為篩選具有優良性狀的乳酸菌，并進一步開發新型動物性和植物性原料發酵乳奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料與培養基

開菲爾粒和開菲爾發酵液均取自內蒙古自治區牧區的牧民家中，共計414 個樣品。

MRS培養基[10]：蛋白胨10 g/L、牛肉膏10 g/L、葡萄糖20 g/L、碳酸鈣10 g/L、酵母浸粉5 g/L、檸檬酸氫二胺2 g/L、乙酸鈉2 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、硫酸鎂0.58 g/L、硫酸錳0.25 g/L、吐溫-80 1 mL/L、瓊脂18 g/L。pH 6.2～6.6，121 ℃滅菌20 min。

1.2試劑與設備

引物27F（5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’），1495R（5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’）[11]由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；HaeⅢ，HinfⅠ，HhaⅠ限制性內切酶、DNA Marker 上海生工生物工程技術服務有限公司。

PCR儀、凝膠成像分析儀 美國Bio-Rad公司；瓊脂糖水平電泳儀 北京市六一儀器廠。

1.3方法

1.3.1 乳酸菌的分離

取1 g開菲爾粒研磨，加入10 mL無菌水溶解，搖勻進行10 倍梯度稀釋，選擇3 個適宜的稀釋度，取0.2 mL稀釋液于MRS培養基，37 ℃培養48 h，從平板上挑取乳酸菌，再在相同的培養基上進行劃線純培養取得單菌落[12]，保藏。

1.3.2 乳酸菌的形態聚類

將分離得到的乳酸菌進行復篩，接種在MRS培養基上，37 ℃培養4 d，觀察乳酸菌的菌落顏色、形態、邊緣是否平整、表面的光滑程度等菌落特征。同時進行過氧化氫實驗、革蘭氏染色和顯微鏡觀察，并記錄細胞的顯微形態，以此對乳酸菌進行初步的形態聚類和保藏。

1.3.3 乳酸菌的分子鑒定

乳酸菌的分子鑒定采用16S rDNA PCR-RFLP序列分析法。將初步形態聚類的乳酸菌每種形態分別隨機選取一株進行分子鑒定，十六烷基三甲基溴化胺（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法[13-14]提取乳酸菌DNA，PCR擴增采用通用引物，正向引物為27F：5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’；反向引物為1495R：5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’。

PCR反應體系包括：雙蒸水34.6 μL，10×Buffer 10 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，10 μmol/L的正向引物2 μL，10 μmol/L的反向引物2 μL，DNA模板2 μL，5 U/μL Taq酶0.4 μL，反應總體積為50 μL。

PCR反應程序[15]：94 ℃ 預變性 5 min，變性 1 min，58 ℃ 退火 1 min，72 ℃ 延伸 2 min，共30 個循環，72 ℃最后延伸10 min。將得到的PCR產物用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳條件為：電壓90 V，時間50 min，溴化乙錠（ethidium bromide，EB）染色20 min，凝膠成像分析儀進行觀察并攝影。

PCR擴增產物進行限制性酶切分析（20 μL）：雙蒸水7 μL，5×Buffer 2 μL，PCR擴增產物10 μL，分別用0.5 U/μL HhaⅠ、HinfⅠ、HaeⅢ 內切酶[16]1 μL進行酶切。酶切條件均為：37 ℃水浴2.5 h，取出，酶切產物用2%瓊脂糖凝膠進行電泳，酶切產物加樣量8 μL與1 μL的10×Loading Buffer混勻后加樣，加入5 μL的Marker為對照，電泳電壓90 V，時間50 min。EB染色20 min，凝膠成像分析儀下進行觀察并攝影。

2　結果與分析

2.1乳酸菌的分離與形態聚類

開菲爾發酵劑經MRS培養基的分離純化共得到67 株乳酸菌，均為過氧化氫實驗陰性、革蘭氏染色陽性的菌株。根據菌落顏色和形態特征，結合顯微鏡下細胞的形態共分為6 種類型，結果見表1。

表1　MRS培養基上分離乳酸菌的菌落形態及數量和比例Table 1 Morphological characteristics, proportion and number of lactic acid bacteria on MRS

不同種類的乳酸菌生長在MRS培養基上，其菌落顏色、形態、大小等都有所不同，結合菌落形態和細胞的顯微形態可進行乳酸菌的判斷和區分。由表1可知，形態2的乳酸菌在開菲爾發酵劑樣品中數量最多，占所分離乳酸菌的62.7%，超過50%，為優勢菌群，其菌落形態和細胞顯微形態如圖1所示。

圖1　優勢乳酸菌的菌落（a）以及細胞顯微（b）形態（40×）Fig.1 Morphology of the predominant lactic acid bacteria colonies (a) and cells (b) (40×)

2.2乳酸菌的16S rDNA PCR-RFLP序列分析

乳酸菌的16S rRNA約含有1 540 個堿基，結構既具有保守性，又具有高變性，16S rDNA是編碼核糖體RNA對應的DNA序列，其原理是從乳酸菌中通過克隆測序或酶切探針雜交獲得16S rDNA序列信息，可作為鑒定乳酸菌的分類依據[17-19]。本研究在對分離得到的乳酸菌進行菌落及顯微形態區分的基礎上，分別從每種形態類型中隨機選擇1 株乳酸菌進行16S rDNA PCR-RFLP序列分析，6 種形態乳酸菌的PCR擴增產物電泳結果見圖2。同時使用HaeⅢ、HinfⅠ和HhaⅠ內切酶對PCR擴增產物進行酶切分析，酶切電泳結果見圖3。

圖2　PCR擴增產物電泳圖譜Fig.2 Electrophoretogram of PCR-amplified products of 16S rDNA

圖3　PCR產物的3 種限制性內切酶酶切分析圖譜Fig.3 Restriction analysis pattern of PCR-amplified products of 16S rDNA

由圖2可知，6 種乳酸菌的PCR擴增片段大小都在1 500 bp左右，經過HaeⅢ、HinfⅠ和HhaⅠ內切酶進行酶切后，可以將其區分為4 種分子類型。Ⅰ類：形態1，PCR產物大小1 492 bp，第1泳道HhaⅠ酶切為4 段：539、409、378、140 bp；第7泳道由HinfⅠ酶切為2 段：1 101、262 bp；第13泳道經HaeⅢ酶切為3 段：870、369、177 bp。Ⅱ類：形態2，PCR產物為1 492 bp，第2泳道經HhaⅠ酶切為4段：541、413、382、222 bp；第8泳道由HinfⅠ酶切為4 段：598、457、312、284 bp；第14泳道經HaeⅢ酶切為3 段：即867、373、170 bp。Ⅲ類：形態3、5，PCR產物1 492 bp，第3和第5泳道經HhaⅠ酶切為4段：535、411、377、219 bp；第9和第11泳道由HinfⅠ酶切為3 段：597、455、269 bp；第15和第17泳道經HaeⅢ酶切為3 段：934、332、166 bp。Ⅳ類：形態4、6，PCR產物1 484 bp，第4和第6泳道經HhaⅠ酶切為4 段：585、530、373、216 bp；第10和第12泳道由HinfⅠ酶切為3段，即595、453和300 bp；第16和第18泳道由HaeⅢ酶切為4 段：473、399、321、162 bp。

根據乳酸菌16S rDNA 擴增產物及3 種限制性內切酶酶切產物電泳圖，利用Image Lab軟件對PCR以及酶切條帶進行解讀，不同形態類型的乳酸菌16S rDNA分析結果，即PCR產物分子質量大小和酶切片段分子質量大小見表2。

表2　6種不同類型的乳酸菌16S rDNA PCR-RFLP分析結果Table 2 results of PFLP analysis of 16S rDNA region for lactic acid bacteria

由表2可知，通過比較不同形態的乳酸菌株PCR擴增產物及酶切片段大小，能夠將這6 種不同形態類型的酵母菌區分為4 種分子類型。乳酸菌的PCR產物分子質量大小為1 484～1 492 bp。經限制性內切酶HaeⅢ、HinfⅠ和HhaⅠ酶切分析后得到4 種不同的酶切片段類型。

把4 種分子類型的乳酸菌隨機選擇1 株進行基因測序，將所得基因序列結果登陸GenBank數據庫，進行BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.Cgi）相似性比對[20-21]，以相似度大于99%確定其屬種，測序結果見表3。

表3　乳酸菌16S rDNA序列分析Table 3 results of 16S rDNA sequence Analysis for lactic acid bacteria

由表3可知，經過形態學區分和分子生物學鑒定（16S rDNA PCR-RFLP分析），可以將6 種形態的乳酸菌歸為4 種，分別為乳明串株菌（L. lactis）、堅強腸球菌（E. durans）、意大利腸球菌（E. italicus）、嗜熱鏈球菌（S. thermophilus）。

通過鄰接法（Neighbor-Joining）構建的系統發育樹判斷乳酸菌的同源關系[22]，如圖4所示。在系統發育樹上同一分支的乳酸菌同源關系最近，由圖4的聚類結果可以清楚地看出所分離乳酸菌的分類情況及各自的種屬名稱。

圖4　基于16S-rDNA序列和 Neighbor-Joining 法構建的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on the sequences of 16S rDNA region and neighbor-jointing method

3　結 論

本研究對傳統乳制品開菲爾發酵劑中分離到的67 株乳酸菌通過形態聚類分為6 種形態類型，16S rDNA PCRRFLP法鑒定為4 種分子類型，其中堅強腸球菌為優勢菌群。本研究將傳統乳酸菌的形態學分析與現代分子技術相結合，通過基因序列分析使菌種鑒定結果的準確性和可靠性提高。研究結果可以反映傳統乳制品中乳酸菌的多樣性，為進一步開發研究新型動物性或植物性蛋白乳發酵飲料奠定了理論基礎。

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Analysis of Lactic Acid Bacteria in Kefir Starter by 16S rDNA PCR-RFLP

LI Jia1, LI Yan1,2, MOU Dehua1,*
(1. College of Bioscience and Bioengineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China; 2. R&D Center for Fermentation Engineering of Hebei Province, Shijiazhuang 050018, China)

Abstract:Lactic acid bacteria in kefir starter cultures were analyzed and identified to obtain strains with outstanding genetic traits and excellent fermentation characteristics. A total of 67 lactic acid bacteria strains were obtained directly from kefir starter cultures by isolation and streak plating. All of these stains could be divided into 6 different groups by conventional microbiological analysis. Then 4 genotypes were classified by RFLP analysis of the 16S rDNA region, including L. lactis, E. durans, E. italicus and S. thermophilus. E. durans was the dominant species accounting for 62.7% of all the isolates.

Key words:kefir starter cultures; lactic acid bacteria; 16S rDNA PCR-RFLP

doi:10.7506/spkx1002-6630-201507029

中圖分類號：TS201.3

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2015）07-0158-04

*通信作者：牟德華（1960—），男，教授，學士，研究方向為農產品加工。E-mail：dh_mou@163.com

作者簡介：李佳（1990—），女，碩士研究生，研究方向為農產品加工。E-mail：974705395@qq.com

收稿日期：2014-07-11