循環(huán)miR-145和miR-484在乳腺癌診斷中的研究*

黃遠帥,周煒鑫,羅彬瑞,郭天虹

(1.四川醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院輸血科，四川瀘州 646000;2.四川醫(yī)科大學研究生院，四川瀘州 646000)

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·論 著·

循環(huán)miR-145和miR-484在乳腺癌診斷中的研究*

黃遠帥1,周煒鑫2,羅彬瑞2,郭天虹2

(1.四川醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院輸血科，四川瀘州 646000;2.四川醫(yī)科大學研究生院，四川瀘州 646000)

目的 探索乳腺癌血漿中差異表達的微小RNA(miRNA)，為檢測乳腺癌尋找全新的生物標志物，并確定其診斷價值。方法 采用定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶反應檢測訓練組30例乳腺癌患者和20例健康對照者血漿中的候選標志物，再盲法驗證20例乳腺癌患者和20例健康對照者候選標志物的診斷效能。結果 訓練組共發(fā)現(xiàn)6個差異表達的miRNA，其中miR-145和miR-484差異最顯著，與其他4個差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。經(jīng)盲法驗證，二者聯(lián)合診斷可有效區(qū)分乳腺癌患者與健康對照患者，受試者工作曲線下面積為0.965，靈敏度和特異度分別為91.3% (95%CI： 85.2%～95.4%)和90.8%(95%CI： 83.7%～93.6%)，陽性預測值為91.0%，陰性預測值為91.0%。結論 血漿中miR-145和miR-484是乳腺癌潛在的診斷標志物。

乳腺癌； 微小RNA-145； 微小RNA-484； 受試者工作曲線下面積； 靈敏度

乳腺癌是由乳腺導管上皮發(fā)生的惡性腫瘤，是婦女的常見惡性腫瘤，占99%，男性僅占1%[1]。全球每年約有120萬婦女患乳腺癌，50萬人死于乳腺癌，我國雖屬乳腺癌低發(fā)地區(qū)，但隨著生活水平的提高和家庭人口的簡單化，近幾年有明顯上升的趨勢[2]。目前乳腺癌的診斷包括：病理學檢查、影像學檢查及血清標志物輔助檢查。病理活檢是乳腺癌診斷的“金標準”，但因為取材和創(chuàng)傷性等限制了它的應用。影像學檢查包括乳腺X線攝影(乳腺鉬靶照相)、CT、彩超、MRI等，是乳腺癌檢測的重要手段，但由于其放射性損傷和假陽性率高，檢測費用也偏高，因此不適合常規(guī)體檢。實驗室檢測項目有癌胚抗原、糖類抗原153等，但是無論是單項檢測還是聯(lián)合應用，其靈敏度和特異度都不夠理想，只能作為一種輔助檢查手段[3-4]。因此尋找一種新的，診斷效能高的乳腺癌診斷標志物顯得十分重要。微小RNA(miRNA)在人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起十分重要的作用，它們參與細胞的分化、增殖、凋亡、黏附及死亡等生物學過程，這些與癌癥的形成及演變都密切相關[5]。近年來，有關miRNA在診斷疾病價值方面的研究越來越受到重視，血清/血漿miRNA表達穩(wěn)定，檢測方便，損傷小，是理想的癌癥診斷標志物。已有相關文獻報道m(xù)iRNA在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及診斷中的應用[6-9]。本研究旨在尋找乳腺癌的特異生物標志物——miRNA，并評價其在乳腺癌診斷中的價值。

1 資料與方法

1.1 標本收集 收集四川醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院2011年7月至2014年7月收治的乳腺癌患者50例作為腫瘤組，年齡34～70歲，平均59歲；TNM分期：Ⅰ期7例，Ⅱ期20例，Ⅲ期18例，Ⅳ期5例。入選條件：(1)女性；(2)病理檢查確診為乳腺浸潤性導管癌；(3)未行手術或放、化療等任何治療；(4)臨床病理資料完整。同時收集門診體檢者40例作為健康對照組，男5例，女35例；年齡35～68歲，平均60歲。將這兩組標本分為訓練組(乳腺癌患者30例和健康對照者20例，用于篩選具有診斷價值的miRNA)和驗證組(乳腺癌患者20例，健康對照者20例，用于鑒別篩選出的miRNA的診斷價值)。腫瘤組血漿標本采集于患者乳腺癌確診后和治療前；兩組受試者均簽署知情同意書。

1.2 定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測訓練組候選標志物 先用Trizol試劑提取腫瘤組和健康對照組血漿標本的總RNA，反轉(zhuǎn)錄和實時定量PCR技術聯(lián)合檢測訓練組50例血漿標本中的miRNA，選擇RNU6B (U6)作為內(nèi)標物質(zhì)進行標準化(△Ct=△CtmiR-△CtU6)，相對表達量以2-△Ct表示[10]。所用試劑為Taqman human miRNA assay kit，按試劑盒說明書步驟操作。

1.3 統(tǒng)計學處理 組間數(shù)據(jù)比較采用Mann-Whitney U檢驗，數(shù)據(jù)之間兩兩比較采用Kruskal-Wallis檢驗，所有數(shù)據(jù)均采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。利用Graph PadPrism V4.03軟件進行數(shù)據(jù)分析和作圖，然后將差異miRNA帶入驗證組驗證其診斷效能[11]。用受試者工作曲線(ROC)及曲線下面積(AUC)比較不同miRNA區(qū)分乳腺癌患者和健康者的能力，計算其靈敏度、特異度。

2 結 果

2.1 乳腺癌特異miRNA篩選 乳腺癌組(30例)和健康對照組(20例)共50例標本經(jīng)qRT-PCR檢測，初步篩選出6個顯著表達的miRNA(miR-16、miR-21、miR-145、miR-191、miR-210、miR-484)，見表1。除了miR-145在乳腺癌組中表達降低以外，其余都呈高表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中miR-145和miR-484在乳腺癌組和健康對照組的表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。圖中方框內(nèi)橫線代表中位數(shù)，方框所表示的區(qū)域指25%～75%百分位數(shù)區(qū)間，方框外的小橫線代表10%～90%的百分位數(shù)區(qū)間，小圓點指在10%～90%的百分位數(shù)區(qū)間以外的值。

表1 乳腺癌組顯著表達的miRNA

圖1 miR-484和miR-145在乳腺癌組和健康對照組中相對表達情況

2.2 miR-484和miR-145鑒別乳腺癌的診斷價值 檢測驗證組miR-484和miR-145的相對表達量，單獨使用miR-484和miR-145作為乳腺癌的標志物作ROC曲線，得到AUC分別為0.928(95%CI： 0.901～0.959)和0.623(95%CI： 0.513～0.725)，見圖2。為了提高腫瘤的診斷價值，聯(lián)合使用miR-484和miR-145一起作為區(qū)分乳腺癌患者與健康對照者的生物標志物作ROC曲線，得到AUC為0.965(95%CI： 0.939～0.984)，見圖3。此時靈敏度和特異度分別為91.3%(95%CI： 85.2%～95.4%)和90.8%(95%CI： 83.7%～93.6%)，陽性預測值為91.0%，陰性預測值為91.0%。

圖2 單獨使用miR-484和miR-145作為乳腺癌標志物的ROC曲線及AUC

圖3 聯(lián)合使用miR-484和miR-145作為乳腺癌標志物的ROC曲線及AUC

3 討 論

本研究通過對30例乳腺癌患者和20例健康對照者血漿使用qRT-PCR檢測，共篩選出6個候選標志物，再通過統(tǒng)計分析找到差異最顯著的2個標志物——miR-484和miR-145，然后進行診斷價值評價。單獨使用miR-484和miR-145作為乳腺癌的診斷標志物時，其ROC的AUC分別為0.928(95%CI： 0.901～0.959)和0.623(95%CI： 0.513～0.725)，診斷效能不甚理想。為了提高乳腺癌的診斷價值，聯(lián)合使用miR-484和miR-145作為區(qū)分乳腺癌患者與健康對照者的生物標志物，ROC的AUC為0.965(95%CI： 0.939～0.984)，此時靈敏度和特異度分別為91.3%(95%CI： 85.2%～95.4%)和90.8%(95%CI： 83.7%～93.6%)，陽性預測值為86%，陰性預測值為91%。說明miR-484和miR-145對乳腺癌的診斷有十分重要的價值，雖然本研究數(shù)據(jù)顯示了較好的診斷效能，但若要應用于臨床，仍需擴大標本量和細化分組，或?qū)θ橄侔┓制诜中驮龠M行標志物的篩選，以提高診斷的特異性。

Li等[12]比較了19例胰腺癌患者和10例健康對照者血清miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-484在胰腺癌中表達顯著增高；Vecchione等[13]發(fā)現(xiàn)在對化療不敏感的卵巢癌中miR-484表達減低；另外關于miR-484與惡性腫瘤的關系，有研究指出其在表皮惡性黑色素瘤中(相對于良性黑色素痣而言)是10個重要的上調(diào)miRNA之一[14]。Volinia和Croce[15]通過分析466例乳腺癌患者的生存情況認為，miR-484水平的高低與Ⅰ、Ⅱ期乳腺癌的預后有重要相關性。miR-145是公認的抑癌基因，在多種腫瘤的發(fā)生中，通過抑制細胞生長從而達到抑癌作用[16-17]?？梢姼鞣NmiRNA在腫瘤中的表達并非特異的，因此，單獨將某一種miRNA作為癌癥的診斷標志物是不理想的，所以在單獨使用miR-484作為乳腺癌的診斷標志物時，在ROC的AUC達0.928的情況下，為了增加其特異性和提高診斷效能，本研究依然考慮將miR-484和miR-145作為聯(lián)合診斷標志物來計算其診斷效能，結果顯示，聯(lián)合診斷ROC的AUC達0.965，診斷效能有了明顯提高。結果中顯示miR-484在乳腺癌中高表達，而miR-145在乳腺癌中低表達，這也為后期研究提供了很好的思路，即研究標志物的作用機制。這樣，標志物不僅可以作為疾病診斷和預后判斷的標準，同時也可以闡明疾病發(fā)生、發(fā)展的機制，縱向加深了研究的深度。

綜上所述，盡管本研究尚有一些局限，但血漿miR-484和miR-145仍不失作為乳腺癌有效的診斷標志物，下一步研究可加大標本量驗證和進行miRNA對乳腺癌發(fā)病機制的研究。

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Research of circulating miR-145 and miR-484 in the diagnosis of breast cancer*

HUANGYuan-shuai1,ZHOUWei-xin2,LUOBin-rui2,GUOTian-hong2

(1.DepartmentofTransfusion,theFirstAffiliatedHospitalofSichuanMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China;2.GraduateSchoolofSichuanMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

Objective To explore the expression changes of miRNAs in the plasma of patients with breast cancer and to evaluate their significance,so as to find new biomarkers for the detection of breast cancer.Methods Plasma miRNA levels of 30 cases of patients with breast cancer and 20 cases of healthy controls in training group were measured by qRT-PCR.The diagnosis values of the candidate miRNAs were validated by blind method in test group (including 20 cases of patients with breast cancer and 20 cases of healthy controls).Results In training group,there were 6 differentially expressed miRNAs (P<0.05),in which miR-145 and miR-451 expressed significantly different from the other 4 miRNAs (P<0.05).The result of blind validation showed that a combination of miR-145 and miR-484 could be effective in the differential diagnosis between patients with breast cancer and healthy controls.And the AUC,sensitivity,specificity,positive predictive value and negative predictive value of combination detection were 0.965,91.3% (95%CI85.2%-95.4%),90.8%(95%CI83.7%-93.6%),91.0% and 91.0%,respectively.Conclusion Plasma miR-145 and miR-484 could be potential specific biomarkers for breast cancer screening.

breast cancer; miR-145; miR-484; ROC curve; sensitivity

四川省衛(wèi)生廳課題資助項目(120336)。

黃遠帥，男，博士，副研究員，主要從事microRNA與疾病關系的研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.24.005

A

1672-9455(2015)24-3623-03

2015-07-20

2015-09-15)