過氧化物酶體增殖物受體γ對血管內皮細胞活性氧生成的影響及機制

王兆君,張寶和

(中國人民解放軍海軍總醫院干部保健科,北京 100048)

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·論 著·

過氧化物酶體增殖物受體γ對血管內皮細胞活性氧生成的影響及機制

王兆君,張寶和△

(中國人民解放軍海軍總醫院干部保健科,北京 100048)

目的 分析過氧化酶體增殖物受體γ(PPARγ)在高糖介導血管內皮細胞活性氧(ROS)生成中的影響與機制。方法 采用33.0 mmol/L D-葡萄糖(高糖)進行介導的人臍靜脈內皮細胞作為高糖介導組，采用二甲基亞砜處理的人臍靜脈內皮細胞作為對照組。分別采用3種PPARγ激動劑吡格列酮、GW9662、京尼平作用于高糖介導組。采用一氧化氮與超氧陰離子熒光探針判定3種藥物對血管內皮細胞一氧化氮與ROS的影響，采用蛋白免疫印跡法評估解耦聯蛋白2表達水平。結果 高糖介導組ROS與一氧化氮表達水平與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。3種藥物中，吡格列酮對血管內皮細胞ROS、一氧化氮與解耦聯蛋白2的作用最強(P<0.05)。結論 PPARγ能夠明顯緩解高糖介導下血管內皮細胞ROS生成，主要通過上調解耦聯蛋白2發揮作用。

血管內皮細胞； 活性氧； 過氧化物酶體增殖物受體γ； 高糖介導

糖尿病是影響人類健康的常見疾病，也是誘發心腦血管病變的主要風險因素，長期血糖異常極易發生心力衰竭、腦卒中、腦梗死等并發癥，致患者生命健康受到更嚴重的影響[1]。血管內皮損傷是心血管疾病發生的早期特征，高糖狀態所形成的糖基化終末產物、線粒體功能障礙等情況均會嚴重損傷血管內皮細胞，而氧化應激是多種潛在風險損害過程的共同環節[2]。既往報道多認為，過氧化酶體增殖物受體γ(PPARγ)能夠發揮良好的代謝保護作用，也可通過抗氧化應激緩解心腦血管功能障礙，但PPAPγ對血管內皮細胞活性氧(ROS)的影響情況及主要機制尚缺乏準確定論[3]。本研究通過建立內皮細胞損傷模型，分析PPAPγ在高糖介導血管內皮細胞ROS中的影響情況，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料 采用上海漢博生物科技有限公司提供的人臍靜脈內皮細胞株。儀器：三洋二氧化碳培養箱，美國Bio-Rad電泳儀與凝膠成像系統，瑞士Kinematica勻漿機，美國Millipore去離子水過濾器，上海光學儀器廠熒光顯微鏡，美國Beckman pH劑與核酸蛋白分析儀。材料：Gibco 胎牛血清、Sigma 4,5-二氨基乙酰乙酸熒光素、二氫乙啶、抗菌藥物、上海通派生物科技有限公司提供的抗GAPDH抗體與抗解耦聯蛋白2抗體、GIBCO DMEM培養基。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 采用低糖DMEM培養基裝置人臍靜脈內皮細胞株，加入1%抗菌藥物與10%胎牛血清，混合均勻后置于5%CO2與37 ℃環境中培養。采用同體積二甲基亞砜處理后為對照組；采用33.0 mmol/L D-葡萄糖培養后作為高糖介導組。分別在高糖介導培養中滴入10 μmol/L吡格列酮、5 μmol/L GW9662與10 μmol/L吡格列酮、10 μmol/L京尼平與10 μmol/L吡格列酮，培養時間為1 d。采用6孔板裝置培養細胞，各組培養均反復開展3次以上。

1.2.2 DHE染色 采用DHE燃料與二甲基亞砜配置0.01 mol/L儲備液，并給予低溫避光儲存。將40 nmol/L的染色液加入至處理的血管內皮細胞中，置于37 ℃環境中培養30 min。采用NaCl、KCL、NaHCO3、MgSO4、KH2PO4、CaCl2與pH劑制成Krebs溶液，再對熒光顯微鏡開展3次沖洗。

1.2.3 內皮細胞一氧化氮檢測 采用5 mmol/L的DAF-2DA加入至處理的血管內皮細胞中，置于37 ℃環境中培養45 min，再應用Krebs溶液沖洗的熒光顯微鏡觀察，選擇FITC濾光片完成照相。

1.2.4 蛋白免疫印跡檢測 提取100 mg細胞，并將裂解液加入至細胞中，有效提取蛋白并進行濃度檢測。獲取50 μg蛋白上樣通過聚丙烯酰胺凝膠電泳轉移至聚偏二氟乙烯膜上，封閉并將Ⅰ抗與Ⅱ抗加入，給予化學發光試劑處理再行X線片曝光，最后采用凝膠成像系統完成分析。

2 結 果

2.1 各組ROS熒光強度、一氧化氮熒光強度、解耦聯蛋白2表達結果 見表1。高糖介導下ROS與一氧化氮表達與同體積二甲基亞砜處理后比較差異有統計學意義(P<0.05)，高糖介導+吡格列酮處理后ROS、一氧化氮熒光強度與解耦聯蛋白2表達同高糖介導組比較差異有統計學意義(P<0.05)，但應用GW9662后ROS、一氧化氮熒光強度及解耦聯蛋白2表達與吡格列酮組比較差異有統計學意義(P<0.05)，而應用京尼平后，ROS與一氧化氮熒光強度同吡格列酮組比較差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 PPARγ對高糖介導人臍靜脈內皮細胞ROS、一氧化氮與解耦聯蛋白2表達的影響

注：與對照組比較，aP<0.05；與高糖介導組比較，bP<0.05；與高糖介導+吡格列酮組比較，cP<0.05。-表示無數據。

2.2 各組圖像表現 見圖1。

注：①為高糖介導；②為高糖介導+吡格列酮；③為高糖介導+吡格列酮+GW9662；④為高糖介導+吡格列酮+京尼平；⑤為對照組。

圖1 各組圖像表現

3 討 論

高糖介導氧化應激水平升高是糖尿病患者發生心腦血管疾病的主要誘發因素，血管內皮細胞則為ROS的首要損傷區域[4]。伴隨臨床藥物不斷推陳出新，眾多研究均證實PPARγ可有效抑制人體代謝變化，對動、靜脈血管發揮良好的保護作用[5-6]。吡格列酮是臨床經常用的PPARγ激動劑，可顯著抑制患者血糖水平，但其血管內皮細胞保護作用仍缺乏證實[7]。為進一步明確PPARγ激動劑吡格列酮對高糖介導血管內皮細胞ROS的影響，本研究通過建立損傷細胞模型，經不同方式培養觀察明確其藥理機制。本研究結果顯示，高糖介導下血管內皮細胞ROS表達明顯上升，而ROS生成抑制作用促使血管內皮保護物一氧化氮水平降低，進而會嚴重加劇血管內皮的損害程度。吡格列酮應用后高糖介導血管內皮細胞的氧化應激受到顯著拮抗作用，其ROS熒光強度顯著低于未應用吡格列酮細胞，而相應一氧化氮熒光強度提高，提示吡格列酮可預防高糖緩解中一氧化氮水平降低情況，從而發揮血管內皮保護的作用。

為進一步明確PPARγ對高糖介導血管內皮細胞ROS產生影響的主要機制，本研究還進一步開展解耦聯蛋白免疫印跡檢驗。國外研究顯示，PPARγ對解耦聯蛋白2 RNA轉錄表達具有上調作用，而解耦聯蛋白2是線粒體內膜中的主要組成蛋白，其介導質子漏對ROS生成具有阻滯作用[8-9]。解耦聯蛋白在氧化應激作用下會迅速提高，其表達提升后可增加抗氧化作用，積極保護正常血管內皮細胞功能，通過調節其表達水平進而加強糖尿病血管內皮損傷的預防性作用[10]。本研究采用蛋白免疫印跡法檢測PPARγ對解耦聯蛋白的影響，結果證實吡格列酮能夠提高高糖環境中的蛋白表達水平，吡格列酮應用前、后解耦聯蛋白2表達水平差異有統計學意義(P<0.05)，由此證實藥物對ROS的主要影響機制為解耦聯蛋白2表達的變化。

綜上所述，PPARγ能夠明顯緩解高糖介導下血管內皮細胞ROS的生成，主要通過上調解耦聯蛋白2發揮其藥物效果，可為糖尿病患者的心血管疾病預防提供良好作用。

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Effect and mechanism of PPARγ on the generation of ROS in vascular endothelial cells

WANGZhao-jun,ZHANGBao-he△

(DepartmentofCadreHealth,NavyGeneralHospitalofPLA,Beijing100048,China)

Objective To investigate the effect and mechanism of PPARγ on the generation of reactive oxygen species (ROS) in vascular endothelial cells induced by high concentration glucose.Methods Human umbilical vein endothelial cells cultured with 33.0 mmol/L D-glucose (high concentration glucose) were set as high concentration glucose induced group,which treated by DMSO were set as control group.High concentration glucose induced group was treated by 3 kinds of PPAPγ agonists,including pioglitazone,GW9662 and genipin.Effects of 3 kinds of drugs on NO and ROS in vascular endothelial cells were assessed by using the fluorescent probes of NO and superoxide anion.The expression level of uncoupling protein 2 was determined by Western blot.Results There were significant differences of the levels of NO and ROS between high concentration glucose induced group and control group induced by DMSO (P<0.05).Among 3 kinds of drugs,pioglitazone had the strongest effects on the levels of ROS,NO and uncoupling protein 2 (P<0.05).Conclusion PPARγ can significantly alleviate the generation of ROS in vascular endothelial cells induced by high concentration glucose,which plays a role mainly through the up-regulation of uncoupling protein 2.

vascular endothelial cell； reactive oxygen species； PPARγ； high concentration glucose induced

王兆君，女，碩士,主治醫師，主要從事老年人群的冠心病和糖尿病方面的研究。△

,E-mail：Zbh129778@sina.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.24.012

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1672-9455(2015)24-3643-02

2015-05-05

2015-07-15)