維格列汀對糖尿病腎病保護作用機制探討*

武紅梅，鄧麗萍，胡園園，龍愛梅，黃 瑩，黃 震，沈明靜

(廣東省深圳市龍崗中心醫院 518116)

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·論 著·

維格列汀對糖尿病腎病保護作用機制探討*

武紅梅，鄧麗萍，胡園園，龍愛梅，黃 瑩，黃 震，沈明靜△

(廣東省深圳市龍崗中心醫院 518116)

目的 研究結締組織生長因子(CTGF)和血管內皮生長因子(VEGF)在大鼠糖尿病腎病發生和發展中的作用，探討維格列汀對糖尿病腎病的保護機制。方法 將60只大鼠分為A、B、C 3組， A、B兩組給予鏈脲佐菌素用于制備大鼠糖尿病腎病模型組,然后分別給予維格列汀8 mg/(kg·d)灌胃連續治療8周和12周，C組為對照組，只給予生理鹽水灌胃。處死大鼠，檢測A、B兩組大鼠血糖、24 h尿蛋白定量和血清CTGF和VEGF表達水平。進一步測定腎重指數,形態學觀察腎小球體積及腎小球基底膜變化，測定腎小球平均截面積(MGA),計算腎小球平均體積(MGV)，比較其MGA和MGV。結果 大鼠糖尿病組血糖、24 h尿蛋白定量和CTGF、VEGF水平明顯高于對照組。經維格列汀治療后大鼠糖尿病腎病組血糖、24 h尿蛋白定量和CTGF、VEGF水平顯著下降，治療12周后以上各項指標比治療8周下降更明顯，腎重指數降低，腎臟肥大程度減輕，且治療前、后CTGF和VEGF水平呈正相關。結論 CTGF和VEGF可作為糖尿病腎病患者病情評估有價值的指標，維格列汀可能部分通過調控CTGF和VEGF的表達而發揮腎臟保護作用。

糖尿病腎病； 結締組織生長因子； 血管內皮生長因子； 維格列汀

糖尿病腎病(DN)是糖尿病主要的微血管并發癥，其病理變化表現為腎小球、腎小管肥大，腎小球腎小管基底膜增厚，腎小球系膜區細胞外基質堆積及腎小球硬化[1]。血管內皮生長因子(VEGF)是一種特異作用于血管內皮細胞的細胞因子，有研究表明，VEGF 參與蛋白尿的產生和腎臟肥大形成，與DN 關系密切[2]。結締組織生長因子(CTGF)在腎臟表達尤為豐富，它介導了轉化生長因子-β(TGF-β)1促進細胞外基質積聚的效應，參與組織纖維化過程，促進腎臟腎小球系膜細胞外基質聚集、腎小球硬化和腎小管間質纖維化[3]。給予二肽基肽酶-4抑制劑(DPP-4)維格列汀通過調控CTGF和VEGF的表達而發揮糖尿病腎臟保護作用，其國內外報道甚少。因此，本研究給予DN大鼠維格列汀治療，通過檢測主要反映DN病情進展的指標(血糖和24 h尿蛋白)及檢測反映腎小球硬化和腎小管間質纖維化的2個項目(CTGF、VEGF)血清學表達水平，旨在探討維格列汀對DN大鼠腎臟的保護作用，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 健康雄性SD大鼠60只，體質量180～200 g，購自廣東醫學院實驗動物中心；鏈脲佐菌素(STZ)，美國sigma公司；DPP-4維格列汀，諾華制藥有限公司產品；尿蛋白試劑盒購自南京建成科技有限公司； CTGF、VEGF酶聯免疫試劑盒購自武漢博士德生物有限公司。

1.2 糖尿病大鼠模型建立 大鼠分為A、B、C 3組， A、B兩組單次腹腔注射65 mg/kg STZ，STZ用0.1 mmo1/L無菌枸櫞酸緩沖液配制(pH=4.5)。72 h后摘除眼球取血測定血糖，血糖大于或等于16.67 mmol/L的大鼠入組為糖尿病大鼠。連續4周測定血糖、24 h 尿蛋白，連續3 d隨機血糖大于或等于16.67 mmol/L ，24 h 尿蛋白大于30 mg/(kg·d)者為DN組。 然后分別給予維格列汀8 mg/(kg·d)灌胃連續治療8周和12周。C組為對照組，只給予生理鹽水灌胃。

1.3 儀器與試劑 血糖及24 h尿蛋白采用速率法,羅氏AU600全自動生化分析儀及配套試劑測定；血清CTGF和VEGF檢測采用ELISA，試劑由深圳晶美公司提供。奧地利AUTH2010全自動酶標儀比色分析試驗數據,操作嚴格按照儀器及試劑使用說明書執行。

1.4 腎重指數檢測 各組大鼠喂養12周時稱體質量，處死大鼠取雙腎并去掉腎包膜，冰鹽水沖洗后濾紙吸干，測雙腎重量。根據公式：腎重/體質量=[雙側腎臟重量之和(g) /體質量(g)] ×1 000進行計算。

1.5 腎臟組織HE染色及腎組織病理圖像分析 取新鮮腎臟組織用生理鹽水沖洗干凈，然后采用甲醛固定，常規脫水、透明、浸蠟、包埋，制成3 μm石蠟切片，行HE染色。采用CIAS-1000型細胞圖像分析系統對病理染色切片(×400倍)進行圖像分析。每個切片隨機選擇8個正切的腎小球，測定腎小球平均截面積(MGA)，取其平均值作為每個標本的MGA，并根據公式：腎小球平均體積(MGV)=1.25×3/2(MGA)計算MGV。

2 結 果

2.1 各組大鼠血糖、24 h尿蛋白及CTGF與VEGF水平變化 見表1。與DN組和對照組相比，維格列汀組血糖、24 h尿蛋白、CTGF和VEGF差異均有統計學意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠血糖、24 h尿蛋白及CTGF與VEGF水平變化

2.2 DN大鼠治療前、后血液CTGF與VEGF水平比較 見表2。由表2可見，DN大鼠治療12周后血清CTGF與VEGF水平顯著低于治療前，差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 DN大鼠治療前、后血清CTGF與VEGF水平比較

2.3 各組大鼠模型腎重指數變化 DN組、維格列汀組、對照組腎重指數分別是(11.02±0.89)、(9.85±0.45)、(6.40±0.39)，維格列汀組腎臟肥大程度減輕，3組差異均有統計學意義(P<0.05)。

2.4 病理切片圖像分析 見表3。DN 組 MGA、MGV明顯擴大，維格列汀各治療組均有不同程度縮小，差異有統計學意義(P<0.05)，而對照組、DN 組 MGA、MGV未見明顯擴大。

表3 各組大鼠MGA MGV的變化

3 討 論

DN是糖尿病的微血管并發癥之一，早期病理特征是腎小球肥大,腎小球及腎小管基底膜增厚，系膜區細胞外基質進行性積聚，后期表現為腎小球、腎小管間質纖維化,最終致蛋白尿和腎衰竭。DN發病機制比較復雜,目前尚不完全清楚,可能與遺傳因素、高血糖、高血壓、血脂異常等代謝紊亂及某些免疫因子調控相關。本研究給予DPP-4抑制劑維格列汀通過調控CTGF和VEGF的表達而發揮糖尿病腎臟保護作用，其國內外報道較少。VEGF是1989年從培養的牛垂體濾泡星狀細胞分離出的一種相對分子質量為(35～45)×103的二聚體糖蛋白[4]。近年強調微血管結構在腎臟疾病進展中的重要性，血管內皮生長因子CTGF、 VEGF與DN的關系成為關注的熱點。 CTGF 是1991 年Bradham 等首先在人臍靜脈內皮細胞的條件培養基中發現的，它是一種由349個氨基酸組成，相對分子質量為(34～38)×103的富含半胱氨酸的分泌肽[5]。CTGF作為TGF-β1的下游因子，在腎臟表達尤為豐富，它介導了TGF-β1促進細胞外基質積聚的效應，參與組織纖維化過程[6]。它的過度表達促進腎臟腎小球系膜細胞外基質的聚集、腎小球硬化和腎小管間質纖維化。

本研究通過測定DN大鼠血糖、24 h尿蛋白、腎重指數和MGA 、MGV變化，觀察腎小球的病理形態改變及大鼠血清學VEGF和CTGF的表達水平。隨著疾病進程加重，本研究結果顯示,各組大鼠在早期就已出現多飲、多食、多尿等糖尿病表現。隨著病情的進展，血糖及24 h尿蛋白明顯高于同期對照組，出現腎臟病理損傷加重等DN表現,由此表明研究過程中腎功能不斷受損，其病理變化表現為腎小球、腎小管肥大，腎小球、腎小管基膜增厚，腎小球系膜區細胞外基質堆積及腎小球硬化。進一步檢測反映腎小球硬化和腎小管間質纖維化2項指標CTGF和VEGF的血清學表達水平發現，DN大鼠血清CTGF和VEGF水平顯著高于對照組，且經過維格列汀治療后DN大鼠血糖及24 h尿蛋白及CTGF和VEGF水平顯著下降，且治療12周后以上各項指標比治療8周下降更明顯，與文獻[7]報道一致。薛菲等[2]認為，VEGF 與尿清蛋白排泄率呈正相關，表明高水平VEGF 會促進蛋白尿產生，促進腎臟組織損傷。本研究結果亦顯示，經過維格列汀治療后CTGF和VEGF水平均顯著下降，且治療前、后CTGF和VEGF 2項指標呈正相關關系，DN大鼠中CTGF和VEGF 2項因子明顯升高于同期對照組，因此推測CTGF和VEGF在大鼠DN發生和發展過程中起到加速作用，進一步導致腎臟病理損傷加重，最終發展為DN所起的作用可能是一對相輔相成的免疫因子。 CTGF是介導腎間質炎性反應最重要炎性反應趨化因子之一，在多種腎臟疾病的發病及進展中發揮作用，是關鍵性細胞因子之一，參與DN 的病理過程，是導致糖尿病腎損害的重要原因[8]。本研究結果顯示，CTGF與DN大鼠彌漫性腎小球硬化與巨噬細胞浸潤有關，提示長期高血糖刺激，使CTGF促使血管內皮細胞VEGF表達增加，其結果導致白細胞黏附增加、血管內皮細胞產生慢性炎性反應，進而促進DN形成。隨DN進一步加重CTGF呈進行性上升趨勢，導致腎小球高濾過、清蛋白排泄、腎小球肥大等，由此提示CTGF和VEGF參與了DN發病及發生和發展。

腸促胰素類藥物是目前用于治療2型糖尿病較新的一類藥物，腸促胰素類藥物有兩類:一類是胰高血糖素樣肽-1類似物，一類是DPP-4抑制劑[9]。臨床研究顯示，此類藥物不僅可有效控制血糖，還能減少體質量增加、降低低血糖發生的風險。與此同時，臨床試驗及動物研究亦發現，腸促胰島素類藥物對DN具有保護作用，為DN的治療提供了新的思路[10]。維格列汀治療組與DN組相比，不僅能明顯降低血糖、尿蛋白，減輕腎臟體積，用藥后腎組織病理損傷也減輕。說明維格列汀具有一定的腎臟保護作用,減少尿蛋白及腎臟保護作用更強。本研究證實,糖尿病患者血CTGF水平可作為診斷早期腎損害較敏感的指標，其水平也與DN嚴重程度呈正相關，有助于監測、判斷其病程進展情況[11]。提示CTGF與VEGF參與DN的發病過程，阻斷或減弱其表達將成為DN更有效的治療途徑。早期對VEGF進行干預，如使用小分子VEGF受體抑制劑及抗黏附分子治療，可降低血管高滲透性，減輕蛋白尿及腎小球肥大，同時阻斷或減弱CTGF表達，將成為DN更有效的治療途徑。

[1]Mahmood D,Singh BK,Akhtar M.Diabetic neuropathy:therapies on the horizon[J].J Pharm Pharmacol,2013,61(5):1137-1145.

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[3]Zhou YH,Wang QY.The role and significance of CTGF in the path genesis of diabetic nephropathy[J].Intern J Endoerinol Metab,2009,26(4):273-276.

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[10]Mahmood D,Singh BK,Akhtar M.Diabetic neuropathy:therapies on the horizon[J].J Pharm Pharmacol,2009,61(9):1137-1145.

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Investigation of protection mechanism of vildagliptin to diabetic nephropathy*

WUHong-mei,DENGLi-ping,HUYuan-yuan,LONGAi-mei,HUANGYing,HUANGZhen,SHENMing-jing△

(CentralHospitalofLonggangDistrict,Shenzhen,Guangdong518116,China)

Objective To study the role of CTGF and VEGF in the occurrence and development of rat diabetic nephropathy,and to investigate the protection mechanism of vildagliptin to diabetic nephropathy.Methods 60 rats were divided into three groups:group A,B and C.Group A and B were treated by streptozotocin for the preparation of diabetic nephropathy rat models.Then the diabetic nephropathy rats of group A and B were treated by continuous intragastric administration of 8 mg/(kg·d) vildagliptin for 8 and 12 weeks respectively.Group C was control group,and just given intragastric administration of saline.The rats were killed,then blood glucose,24 h urine protein,and the expression levels of CTGF and VEGF of rats in group A and B were detected.Furthermore,kidney weight index,morphological observation of glomerular volume,glomerular basement membrane changes were determinated as well as the glomerular average sectional area (MGA) and the average calculated glomerular volume (MGV) were compared.Results The levels of blood glucose,24 h urine protein,CTGF and VEGF of group A and B were significantly higher than those of control group.After vildagliptin treatment,the levels of blood glucose,24 h urine protein,CTGF and VEGF reduced in both of group A and B,and those in group B reduced more significantly than group A.At the same time,both of the kidney weight index and the degree of renal hypertrophy reduced after treatment,and the levels of CTGF and VEGF were positively correlated before and after treatment.Conclusion CTGF and VEGF could serve as a valuable indexes of diabetic nephropathy.Vildagliptin might play a role of renal protection via partially regulate the expression of CTGF and VEGF.

diabetic nephropathy; CTGF; VEGF; vildagliptin

廣東省深圳市龍崗區科技發展資金2013年度課題資助項目(YS2013075)。

武紅梅，女，碩士，主任醫師,主要從事內分泌及代謝疾病臨床與基礎研究。△

，E-mail： mingjingshen1962@126.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.24.013

A

1672-9455(2015)24-3645-03

2015-05-13

2015-08-21)