NS1抗原捕獲ELISA在登革熱篩查及診斷中的應用

李啟欣，朱嫦琳，陳文翠，李煒煊

(廣東省佛山市第一人民醫院檢驗科 528000)

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·論 著·

NS1抗原捕獲ELISA在登革熱篩查及診斷中的應用

李啟欣，朱嫦琳，陳文翠，李煒煊△

(廣東省佛山市第一人民醫院檢驗科 528000)

目的 評價檢測登革病毒NS1抗原捕獲酶聯免疫吸附試驗(NS1-ELISA)在登革熱實驗室診斷中的應用價值。方法 選取2014年9～10月在廣東省佛山市第一人民醫院就診的疑似登革熱病毒感染的患者共173例，分別采用NS1-ELISA、實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)和膠體金免疫層析法(以下簡稱金標法)對其血清中的登革病毒標志物進行檢測，比較3種方法對登革熱診斷的靈敏度、特異性、預測值、似然比、約登指數和卡帕值。結果 173例疑似患者中共88例(50.87%)被確診為登革熱患者，檢測結果陽性率最高為金標法，顯著高于NS1-ELISA和PCR；NS1-ELISA敏感度、陰性預測值和約登指數均高于PCR和金標法，陰性似然比低于PCR和金標法，3種方法的敏感度差異無有統計學意義(P>0.05)，PCR和NS1-ELISA特異性顯著優于金標法，差異有統計學意義(P<0.05)，PCR特異性高于NS1-ELISA，但差異無統計學意義(P>0.05)。結論 NS1-ELISA對登革熱的檢測效能和應用價值優于PCR和金標法，可作為登革熱暴發或散發的篩查及確診方法。

登革熱； 登革病毒； NS1抗原； 酶聯免疫吸附試驗

登革熱是一種全球性的急性蟲媒傳染病，由登革病毒引起，經伊蚊傳播，多流行于熱帶和亞熱帶，尤其是東南亞國家，是我國重點監測與控制的傳染病之一[1]。廣東省是登革熱高流行區，2005～2012年全國報道發病人數中，廣東省病例占全國的71.65%，暴發病例所占比例更高達85.68%[2]。2014年夏、秋季，廣東地區再次暴發登革熱，至2014年10月止，全省確診病例超過4萬例，因此，及時準確的檢測和預防十分重要。目前基層醫院常用的檢測方法為膠體金免疫層析法，初篩陽性后再送當地疾病預防控制中心，采用熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)確診，檢測周期較長，不利于早期發現，且檢測要求較高。針對登革病毒 NS1抗原的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)具有耗時較短且敏感性和特異性較好的特點，本研究對此3種方法進行比較，為尋找快速準確診斷登革熱的方法提供重要實驗室依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 標本來自2014年9～10月于本院就診的疑似登革熱病毒感染患者共173例，其中男90例，女83例，年齡1～83歲，平均(35.13±20.18)歲。采用普通干燥管采集靜脈血4 mL，3 000 g離心15 min后分離血清待測。

1.2 檢測原理

1.2.1 針對登革病毒 NS1抗原的ELISA(以下簡稱NS1-ELISA) 登革病毒NS1抗原檢測試劑盒購自北京萬泰生物藥業股份有限公司，采用雙抗體夾心ELISA原理，檢測樣品中登革病毒NS1抗原。

1.2.2 實時熒光定量PCR(以下簡稱PCR) 登革熱病毒通用型核酸檢測試劑、登革熱DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4型病毒核酸熒光檢測試劑盒均購自上海之江生物科技有限公司，核酸提取試劑盒為Qiagen公司產品。

1.2.3 膠體金免疫層析法(以下簡稱金標法) 登革熱快速診斷試劑盒購自澳大利亞PanBio公司。

1.3 檢測方法 全部送檢血清標本同時采用3種方法進行檢測，所有方法均嚴格按照說明書進行操作。

1.4 確診標準 按衛生部發布的登革熱診斷標準(WS216-2008)[3]進行確診。

1.5 統計學處理 采用SPSS19.0軟件，采用四格表χ2檢驗進行組間比較，計算3種方法對登革熱診斷的敏感度、特異性、陽性預測值、陰性預測值、陽性似然比、陰性似然比、約登指數(YI)及Kappa(κ)值。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 根據患者的登革熱診斷標準(WS216-2008)送檢的173例疑似患者中，88例(50.87%)被確診為登革熱，85例(49.13%)為其他病因引起的發熱。

2.2 3種方法檢測登革熱檢出率分析 見表1。173例登革熱疑似患者中，檢測結果陽性率(72.25%，125/173)最高為金標法，高于NS1-ELISA的(58.96%，102/173)和PCR的(54.34%，94/173)，差異有統計學意義(χ2=6.776，P=0.009；χ2=11.955，P=0.001)，NS1-ELISA又高于PCR，但差異無統計學意義(χ2=0.753，P=0.385)。

2.3 3種方法對登革熱的檢測效能分析 3種方法對登革熱疑似患者血清檢測的靈敏度、特異性、陽性預測值、陰性預測值、陽性似然比、陰性似然比、YI和κ值見表2。由表2可見，NS1-ELISA敏感度、陰性預測值和YI均高于PCR和金標法，陰性似然比低于PCR和金標法，κ值與PCR相等，特異性和陽性似然比明顯高于金標法，稍低于PCR，由此表明NS1-ELISA對登革熱診斷價值較高。

表1 3種方法檢測登革熱檢出率分析

表2 3種方法對登革熱檢測效能

2.4 3種方法敏感度和特異性比較 見表3。對3種方法的敏感度和特異性進行兩兩比較，結果顯示敏感度差異無統計學意義(P>0.05)，PCR和NS1-ELISA特異性顯著優于金標法，差異有統計學意義(P<0.05)，PCR特異性高于NS1-ELISA，但差異無統計學意義(P=0.408)。

表3 3種方法敏感度和特異性比較

3 討 論

登革熱是世界上尤其是熱帶地區最重要的蟲媒傳播疾病之一。登革熱檢測有登革熱病毒分離、抗體血清學檢測及針對病毒核酸分子生物學檢測等多種方法。病毒分離法準確可靠，是登革病毒檢測的金標準，但操作繁瑣，敏感度低，不宜用于早期診斷[4]。血清學檢測方法主要有血凝抑制試驗、間接免疫熒光抗體試驗、IgM//IgG捕獲ELISA及快速免疫層析法等，都是針對登革病毒抗體進行檢測，各種方法都存在一定的優缺點[5-6]。分子生物學方法主要包括反轉錄-PCR、實時熒光定量PCR、轉錄介導的擴增方法等，敏感性更高，可用于早期診斷，但檢測要求較高，不適合于基層醫院開展[7]。

NS1-ELISA檢測的是登革病毒的NS1抗原，NS1是登革病毒的非結構蛋白，僅存在于4種型別的登革病毒而不存在于其他黃病毒屬病毒，因此無交叉反應，特異性好。NS1在發病早期即出現，檢測窗口寬，可達到早期檢測和隨時檢測的目的，靈敏度和特異性較高，應用前景良好[8]。本研究選用的金標法采用未稀釋的血清檢測，根據測試卡上的條帶直接判斷抗體類型(如IgM、IgG) 和感染情況(如初次感染、二次感染)[9]。金標法簡單實用、結果直觀，可用于疾病流行期間的疾病初篩，增加檢出率，但由于特異性較差，在散發情況下可能會產生較多的假陽性。PCR是在反應體系中加入熒光基團，將熒光技術與常規PCR技術結合，對病毒核酸進行精確定量，敏感度和特異性好，但一般僅在地區疾病控制中心及少部分大型綜合醫院開展，不用于常規篩查。

本研究結果顯示，對送檢的登革熱疑似患者，金標法陽性率顯著高于NS1-ELISA和PCR，差異有統計學意義(P<0.05)，3種方法檢測的陽性率均高于文獻[10-11]的報道，與本年度登革熱暴發流行及試劑廠家不同有關。高流行率導致確診患者在疑似患者中的比例上升，因此檢出率隨之上升。不同廠家生產的試劑采用的檢測抗體和標記方法不完全相同，敏感度和特異性也存在一定差異。從檢測效能分析結果可見，3種方法的敏感度未發現差異，NS1-ELISA和PCR的特異性相當(81.18%vs. 85.88%)，均顯著高于金標法(50.59%)，差異有統計學意義(P<0.05)，略低于文獻[12-13]報道的數據。由此提示金標法敏感度好但特異性較差，僅適合于初篩而不能用于確診。NS1-ELISA和PCR特異性較好，可用于登革熱的實驗室輔助診斷。YI又稱為正確指數，是綜合評價篩查試驗真實性的方法，YI越大說明篩查試驗效果越好，真實性越大。本研究結果表明，NS1-ELISA 和PCR的YI均達到0.8左右，由此提示兩種方法對登革熱有較好的篩查價值。對3種方法進一步評價結果顯示，PCR和NS1-ELISA的陽性預測值和陰性預測值均在90%左右，由此表明這兩種方法檢測結果與實際符合程度較高。由于在選擇診斷試驗時應當選擇陽性似然比大而陰性似然比小的試驗，因此，PCR和ELISA都可作為登革熱的診斷手段。

考慮到PCR檢測要求較高，需要特定的檢測環境和技術人員，且易出現假陽性，因此目前尚未在臨床上廣泛使用。本研究證明，NS1-ELISA與PCR檢測效能相當，敏感度、YI甚至高于PCR，且NS1-ELISA檢測的是病毒抗原，不同于傳統ELISA，無需等到患者恢復期出現抗體，在整個發病期均可檢測到，可用于登革熱的早期診斷[4]。此外，由于ELISA對設備要求不高，操作簡便，價格相對低廉，易實現批量檢測，因此可作為登革熱暴發或散發的篩查及確診方法。目前常用的實驗室手段為金標法篩查陽性后送當地疾病預防控制中心進行PCR確診，NS1-ELISA可簡化流程，節省人力物力，大大縮短實驗室診斷時間，可作為登革熱篩查和早期診斷的首選方法，可于臨床推廣應用。

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Application of NS1 antigen capture ELISA in screening and diagnosis of dengue fever

LIQi-xin,ZHUChang-lin，CHENWen-cui，LIWei-xuan△

(DepartmentofMedicalLaboratory,theFirstPeople′sHospitalofFoshan,Foshan,Guangdong528000,China)

Objective To assess the application value of NS1 antigen capture ELISA (NS1-ELISA) in the laboratorial diagnosis of dengue fever.Methods Serum samples were obtained from 173 borderline cases of dengue virus infection in the First People′s Hospital of Foshan from September to October in 2014.Serum markers of dengue virus were detected by NS1-ELISA,PCR and immunogold labeling assay (IGLA),respectively.The sensitivity,specificity,predictive value (PV),likelihood ratio (LR),Youden′s index (YI) and kappa value of 3 methods in diagnosis of dengue fever were assessed.Results Among 173 patients,there were 88 cases (50.87%) diagnosed to be dengue fever.IGLA had the highest positive rate,which was significantly higher than NS1-ELISA and PCR.The sensitivity,PV,and YI of NS1-ELISA were higher than IGLA and PCR,while LR was lower.No significant differences were found in sensitivities among 3 methods (P>0.05).The specificities of NS1-ELISA and PCR were both higher than IGLA (P<0.05),but no significant differences of the specificities were found between NS1-ELISA and PCR (P>0.05).Conclusion NS1-ELISA had better detection efficiency and application value than PCR and IGLA,which could be the ideal method for screening and diagnosis of dengue fever when it outbroke or sporadically occured.

dengue fever; dengue virus; NS1 antigen； ELISA

李啟欣，男，本科，主任技師，主要從事生化免疫檢驗和實驗室管理。△

,E-mail:lwx21cn@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.24.024

A

1672-9455(2015)24-3673-03

2015-06-04

2015-08-10)