自噬相關基因16L1單核苷酸多態性與宮頸癌相關性研究*

劉亞敏，趙鳳容，凌 玲,殷 勤

(重慶市紅十字會醫院/重慶市江北區人民醫院 400020)

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·臨床探討·

自噬相關基因16L1單核苷酸多態性與宮頸癌相關性研究*

劉亞敏，趙鳳容，凌 玲△,殷 勤

(重慶市紅十字會醫院/重慶市江北區人民醫院 400020)

目的 檢測自噬相關基因(ATG)16L1基因rs2241880位點的多態性，研究該位點與宮頸癌是否具有相關性。方法 收集宮頸癌病例(病例組)及健康體檢者(健康對照組)標本各100例，提取細胞基因組DNA進行基因片段擴增，觀察瓊脂糖凝膠電泳PCR產物及DNA序列測定。結果 ATG16L1基因第9外顯子第47位等位基因位點為等位基因多態性位點，病例組與健康對照組ATG16L1基因型及等位基因頻率分布比較無差異。結論 深入研究基因型變異等有利于揭示宮頸癌的發病機制，為宮頸癌的早診斷、早治療提供新思路。

宮頸癌； 自噬溶酶體； 單核苷酸多態性自噬相關基因16L1基因

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤，高危型人乳頭瘤病毒(HPV)感染是導致宮頸癌的主要原因之一[1]。HPV感染是宮頸癌發生過程中是必要的環境因素，但近年眾多研究表明，個體遺傳因素的改變也起非常重要的作用。免疫調節基因、癌基因及抑癌基因等內在因素的變化導致細胞穩態失衡，可能是宮頸癌發生的重要原因[2]。在腫瘤發生的研究中，細胞自噬機制的作用受到越來越多的關注[3]。自噬體系可能在細胞內發揮著抑制腫瘤發生的作用。自噬相關基因(ATG)16L1是自噬相關基因之一，在自噬體形成過程中，ATG16L1與ATG12、ATG5組成聚合物，引導LC3泛素化，從而形成自噬體的外膜結構，并促進自噬體外膜的分離和延伸[4]。ATG16L1的缺陷和突變引起自噬系統破壞，從而造成免疫監視系統功能障礙，并最終導致腫瘤發生。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 病例組 收集2012年3月至2015年3月來自重慶市紅十字會醫院及酉陽縣人民醫院就診的宮頸癌患者100例，所有患者確診依據來源于宮頸活組織病理檢查，診斷符合國際標準，宮頸病理學檢查提示宮頸鱗癌/腺癌患者；宮頸癌前病變及原位癌不納入該研究。采集全血標本3 mL，EDTA抗凝，本研究方案經重慶市紅十字會醫院醫學倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.1.2 健康對照組 收集2012年3月至2015年3月來自重慶市紅十字會醫院體檢中心健康體檢者100例，有性生活史1年以上；宮頸細胞學檢查陰性；無子宮頸錐切和子宮切除病史；目前未懷孕；無遺傳性疾病家族史。采集全血標本3 mL，EDTA抗凝。

1.2 基因組DNA提取 采集EDTA抗凝靜脈血3 mL，采用離心柱法(大連寶生物)提取細胞基因組DNA，具體操作按照試劑說明書進行。以紫外分光光度法測定基因組DNA純度和濃度，-80 ℃低溫保存備用。

1.3 基因片段擴增 根據國外文獻報道的ATG16L1基因的多態性位點rs2241880位于第9外顯子，以primer design5軟件設計引物，擴增包含該位點的DNA片斷。上游引物為5′-ATT TGA TGA GGA GTA AAC CTC TG-3′，下游引物為5′-GGG GCT GAA GCA TAC TTA CT-3′，產物200 bp左右。PCR體系為50 μL：其中DNA模板500 ng，PCR上、下游引物各20 pmol，Taq DNA聚合酶2.5 U，dNTP及鎂離子常規劑量，以去離子水補充至50 μL。

1.4 PCR擴增條件 94 ℃預變性5 min；4 ℃變性30 min，55 ℃退火30 min，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 min延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳PCR產物，觀察條帶大小是否符合預期。產物4 ℃保存備用。

1.5 測序 PCR產物進行DNA序列測定，由生物技術公司完成。ATG16L1第9外顯子47位為多態性位點，蘇氨酸ACT變為丙氨酸GCT，測序可能出現以下情況：純合突變GG，黑色單峰；純合突變AA，綠色單峰；雜合突變G/A，黑綠雙峰。HPV的檢測以熒光定量PCR檢測HPV DNA量，并進行基因型分析。

1.6 統計學處理 所有統計處理采用SPSS19.0軟件分析。根據所測位點各基因型分布計算基因型和等位基因頻率，并行Hardy-weinberg平衡檢驗評估病例組和健康對照組具有代表性基因型；采用χ2檢驗比較各組間基因頻率和等位基因頻率，以P<0.05為差異有統計學意義。以優勢率(OR)及其95%可信區間(95%CI)表示各基因型發生頻率在不同比較組間的相對危險度，其相對危險度近似估計值比值和估計各研究因素與宮頸癌發病風險的關系，所有統計檢驗均為雙側概率檢驗。

2 結 果

2.1 PCR擴增產物電泳結果 結果顯示，病例組及健康對照組PCR擴增產物電泳產物在MAKER 100～200 bp處均可見明亮條帶，提示擴增產物應為193 bp。

2.2 PCR產物核苷酸序列測定 測序結果顯示，ATG16L1基因第9外顯子第47位等位基因位點為等位基因多態性位點，該位點由蘇氨酸突變為丙氨酸(ACT變為GCT)。

2.3 ATG16L1基因測序結果 病例組與健康對照組比較，兩組標本遺傳平衡檢驗差異無統計學意義(P>0.05)，由此表明標本具有代表性。病例組與健康對照組ATG16L1基因型及等位基因頻率分布比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組基因測序結果[n(%)]

2.4 ATG16L1基因主要表達于上皮細胞、淋巴細胞及巨噬細胞 其編碼的ATG16L1蛋白與自噬蛋白形成復合物，Cadwell等報道了ATG16L1在Paneth細胞中的獨特作用。Paneth細胞是小腸內的一種上皮細胞，分泌ATG16L1蛋白，含有抗菌肽和溶菌酶顆粒；異常 Paneth細胞分泌顆粒缺乏，導致清除微生物能力下降。ATG16L1缺陷會阻斷ATG12-ATG5結合到細胞膜，從而影響微管連接蛋白l輕鏈3結合到磷脂酰乙醇胺，最后影響自噬體形成，導致自噬過程障礙及一系列病原體清除能力下降。另外，在缺乏ATG16L1表達的巨噬細胞中在細菌內毒素刺激下會產生大量炎性反應性因子，如白細胞介素-1和白細胞介素-18。

3 討 論

宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤。目前認為宮頸HPV感染是宮頸癌發生的基本原因，但僅有一小部分HPV感染者最終發生宮頸癌，提示其他因素和宿主遺傳易感性影響HPV感染的結局[5]。腫瘤遺傳水平的改變包括：基因結構的異常改變，如單核苷酸多態性、微衛星不穩定性、基因組拷貝數增加或減少、基因擴增、重排和缺失等，這類效應并不改變基因序列，但影響基因表達狀況[6]。其中單核苷酸多態性(SNP)是指基因水平上由單個核苷酸的變異引起的DNA序列多態性,它是人類可遺傳變異中最為常見的一種，SNP在人類基因組中廣泛存在，估計其總數可達300個以上。SNP所表現的多態性只涉及單個堿基的變異，這種變異可由單個堿基的轉換、顛換、插入及缺失所引起，其可引起基因表達水平及表達產物功能的改變導致疾病發生，成為復雜性疾病的危險因素之一。近年研究表明，一些基因的SNP與宮頸癌的發生具有相關性[7]。有研究報道，細胞表面分子CD83基因的SNP位點rs750749、rs9296925和rs9370729與宮頸癌易感性具有相關性。錢年鳳等[8]報道，炎性因子白細胞介素-1B的SNP位點C511T與宮頸癌易感性有顯著性相關。其他一些基因多態性位點也被研究證實可能與宮頸癌易感性相關，包括人類白細胞抗原DRB1、細胞色素p450 1A1、p53 codon 72、白細胞介素-8、基質金屬蛋白酶等[9-11]。這些報道表明，宮頸癌作為一種復雜性疾病，可能有多種遺傳因素與之相關。本研究通過對100例宮頸癌患者及100例健康者的血液標本進行采集，采用PCR和基因測序技術，檢測ATG16L1基因rs2241880位點的多態性，研究該位點與宮頸癌是否具有相關性；提取細胞基因組DNA；以紫外分光光度法測定基因組,以熒光定量PCR檢測HPV DNA量，并進行基因型分析。ATG16L1基因測序HH BGHXXXXXXB結果顯示，病例組與健康對照組比較，兩組標本遺傳平衡檢驗差異無統計學意義(P>0.05)，表明樣本具有代表性。病例組與健康對照組ATG16L1基因型及等位基因頻率分布比較差異無統計學意義(P>0.05)。

細胞自噬是近年來生命科學的研究熱點之一，其與腫瘤的相關性研究仍處于起步階段，嘗試解答多態性與宮頸癌相關性的機制，但腫瘤的發生和發展是一個多因素、多階段及多基因變異的綜合病變過程。深入研究這些基因，將有利于進一步揭示宮頸癌的發病機制，為宮頸癌的早期診斷、治療療效、預后評價和指導開發新的抗腫瘤藥物提供新思路，徹底了解遺傳因素在宮頸癌發生和發展中的作用，有待更深入、更大規模的研究。

[1]Sheinfeld Gorin SN,Glenn BA,Perkins RB.The human papillomavirus (HPV) vaccine and cervical cancer:uptake and next steps[J].Adv The,2011,28(8):615-639.

[2]Horn LC,Raptis G,Fischer U.Familial cancer history in patients with carcinoma of the cervix uteri[J].Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol,2002,101(1):54-57.

[3]Deretic V,Levine B.Autophagy,Immunity,and microbial adaptations[J].Cell Host Microbe,2009,5(6):527-549.

[4]Mizushima N,Kuma A,Kobayashi Y,et al.Mouse Apg16L,a novel WD-repeat protein,targets to the autophagic isolation membrane with the Apg12-Apg5 conjugate[J].Cell,2003,116 (Pt 9):1679-1688.

[5]豐有吉，沈鑑.婦產科學[M].北京：人民衛生出版社,2011:325-331.

[6]陳杰，李甘地.病理學[M].北京：人民衛生出版社,2012:148-150.

[7]Yu KJ,Rader JS,Borecki I,et al.CD83 Polymorphisms and cervical cancer risk[J].Gynecol Oncol,2009,114(2):319-322.

[8]錢年鳳,韓素萍,陳小軍.等.IL-1B及 IL-1R 基因多態性與江蘇地區宮頸癌遺傳易感性相關[J].南京醫科大學學報，2008，28(5)：629-634.

[9]黃金雙,林蓓,齊躍,等.人類白細胞抗原DRB 1等位基因多態性與子宮頸癌易感性的相關性研究[J].中華婦產科雜志,2006,41(10)：715-716.

[10]石玉榮,耿建,程龍強.細胞色素P4501A1基因多態性與宮頸癌的相關性[J].復旦學報,2011，38(5)：428-431.

[11]Wu S,Lu S,Tao H,et al.Correlation of polymorphism of IL-8 and MMP-7 with occurrence and lymph node metastasis of early stage cervical cancer[J].J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci,2011,31(1):114-119.

重慶市衛生局科研資助項目(2012-2-370)。△

，E-mail：381250530@qq.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.24.043

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1672-9455(2015)24-3722-02

2015-06-13

2015-08-22)