激活素A 對(duì)小鼠中性粒細(xì)胞活性的調(diào)控作用①

齊 妍 崔雪玲 閆 青 吳 倩 柳忠輝 葛敬巖 (吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫系，長(zhǎng)春 130021)

中性粒細(xì)胞是血液循環(huán)中數(shù)量最多的白細(xì)胞，是機(jī)體防御細(xì)菌和真菌等病原體重要的固有免疫細(xì)胞，具有吞噬、遷移及呼吸爆發(fā)等細(xì)胞功能［1］。活化的中性粒細(xì)胞可以通過(guò)呼吸爆發(fā)產(chǎn)生大量超氧陰離子及活性氧(Reactive oxygen species，ROS)造成微生物的損傷和死亡［2，3］。中性粒細(xì)胞還參與多種炎癥相關(guān)性疾病的發(fā)生發(fā)展，近幾年通過(guò)調(diào)控中性粒細(xì)胞來(lái)減少炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體損傷的相關(guān)研究逐漸增多。激活素A(Activin A)屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(Transforming growth factor β，TGF-β)超家族的多功能免疫調(diào)節(jié)因子，激活素A 異常表達(dá)與炎性疾病密切相關(guān)［4］，已知多種免疫細(xì)胞可產(chǎn)生激活素A，包括單核巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞及Th2 細(xì)胞等［5-7］。最近研究表明中性粒細(xì)胞也是激活素A 的主要來(lái)源細(xì)胞之一，炎癥活化中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞均可快速釋放大量的激活素A［8］，激活素A 又以自分泌/旁分泌形式調(diào)控巨噬細(xì)胞功能，但激活素A 能否以自分泌/旁分泌形式調(diào)控中性粒細(xì)胞活性，以及調(diào)控中性粒細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，仍無(wú)確切報(bào)道。因此，本研究擬通過(guò)檢測(cè)中性粒細(xì)胞激活素受體表達(dá)(ActR)以及中性粒細(xì)胞活性，闡述激活素A 調(diào)控中性粒細(xì)胞的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6 小鼠，雄性，8～10 周，由吉林大學(xué)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑 激活素A 購(gòu)自R＆D 公司;Percoll購(gòu)自GE Healthcare 公司;PE 標(biāo)記Anti-Gr-1 購(gòu)自ebioscience 公司;APC 標(biāo)記Anti-ActRⅡA 購(gòu)自R＆D公司;超氧化物檢測(cè)試劑盒及活性氧檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天公司。

1.3 分離中性粒細(xì)胞 每只小鼠腹腔注射9%酪蛋白1 ml，第一次注射后24 h 重復(fù)注射一次同等劑量的酪蛋白，第二次注射后3 h 收集小鼠腹腔積液細(xì)胞。將收集好的細(xì)胞用冷PBS 洗滌3 次后，用含10%小牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基重懸，轉(zhuǎn)移至50 ml 培養(yǎng)瓶中，37℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h 后，收集懸浮細(xì)胞。將收集好的細(xì)胞(5 ×107ml-1)與100% Percoll 以1∶9的比例在超速離心管中混合，將混合液4℃，190 000 r/min 離心65 min，棄掉含有巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的第一層液體，收集第二層液體中的細(xì)胞。將收集好的細(xì)胞用迪夫快速染色試劑染色觀察，并用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Gr-1+細(xì)胞，此方法分離的中性粒細(xì)胞純度大于90%。

1.4 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)ActRⅡA 及Gr-1表達(dá) 使用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)中性粒細(xì)胞激活素ⅡA 型受體(ActRⅡA)表達(dá)。將分離后的中性粒細(xì)胞用冷FACS 液洗滌細(xì)胞2 次，加入兔抗ActRⅡA(1∶500)，4℃孵育過(guò)夜，冷FACS 液洗滌細(xì)胞2 次，加入FITC 標(biāo)記Anti-Rabbit-IgG、PE 標(biāo)記Anti-Mouse-Gr-1 及DAPI，4℃避光孵育30 min，F(xiàn)ACS 液洗滌2 次，熒光倒置顯微鏡下觀察拍照。同型對(duì)照組加入兔IgG 代替兔抗ActRⅡA，PE 標(biāo)記IgG 代替PE 標(biāo)記Anti-Mouse-Gr-1 進(jìn)行孵育。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Gr-1 及ActRⅡA 表達(dá) 使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Gr-1 及ActRⅡA 表達(dá)。將分離后的中性粒細(xì)胞用冷FACS 液洗滌細(xì)胞2 次，加入100 μl 冷的FACS 液重懸，分別加入APC 標(biāo)記Anti-Mouse-ActRⅡA 及PE 標(biāo)記Anti-Mouse-Gr-1，4℃避光孵育30 min，F(xiàn)ACS 液洗滌2 次，300 μl FACS 液重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，同型對(duì)照組加入APC 標(biāo)記Mouse-IgG 及PE 標(biāo)記Mouse-IgG。

1.6 Western blot 檢測(cè)激活素A 刺激后Smad3 表達(dá) 將分離好的中性粒細(xì)胞(3 ×106)加入激活素A(0～10 ng/ml)，37℃，5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min。收集細(xì)胞，分別加入蛋白裂解液［1% Triton X-100，500 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L PMSF，4 μg/ml leupeptin，1 μg/ml aprotinin］，充分裂解后，離心取上清。蛋白通過(guò)SDS-PAGE 分離后，轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯膜(PVDF)上，分別加入兔抗ActR ⅡA 抗體(1 ∶1 000)，兔抗Smad3 抗體(1 ∶500)，兔抗磷酸化Smad3(p-Smad3)抗體(1∶500)及兔抗GAPDH 抗體(1∶1 000)孵育，洗滌3 次后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔 IgG 孵育，最后加入ECL 試劑(ECLPlus;Amersham Pharmacia Biotech)，通過(guò)化學(xué)發(fā)光成像檢測(cè)目的蛋白。

1.7 檢測(cè)激活素A 刺激后中性粒細(xì)胞內(nèi)ROS 水平 利用熒光探針DCFH-DA 進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)活性氧(Reactive oxygen species，ROS)檢測(cè)，DCFH-DA 本身無(wú)熒光，可被細(xì)胞內(nèi)酯酶水解生成DCFH，ROS 可將無(wú)熒光的DCFH 氧化生成有熒光的DCF，最后通過(guò)測(cè)定熒光強(qiáng)度從而檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS 水平。將分離好的中性粒細(xì)胞(1 ×106)加入激活素A(0～10 ng/ml)，37℃，5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h。去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入DCFH-DA，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3 次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。使用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm。

1.8 檢測(cè)激活素A 刺激后O2-的產(chǎn)生 O2-的檢測(cè)使用超氧化物檢測(cè)試劑盒(分解水溶性四唑鹽，WST-1)。將分離好的中性粒細(xì)胞(1 ×106)加激活素A(0～10 ng/ml)，37℃，5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h。去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入含有WST-1 的反應(yīng)液，37℃避光孵育5 min，使用酶標(biāo)儀在450 nm測(cè)定吸光度值A(chǔ)。

1.9 檢測(cè)激活素A 刺激后NO 分泌水平 將分離好的中性粒細(xì)胞(1 ×106)加入激活素A(0～10 ng/ml)，37℃，5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h。收集上清，Griess 法檢測(cè)NO，將上清液與Griess 試劑［0.1% N-(1-萘基)乙二胺二鹽酸鹽，1%對(duì)氨基苯磺酸和2.5%磷酸］等體積混合，室溫孵育5 min。使用酶標(biāo)儀在540 nm 測(cè)定吸光度值A(chǔ)。雙蒸水稀釋的亞硝酸鹽作為標(biāo)準(zhǔn)品，濃度從1～100 mmol/L。

1.10 激活素A 刺激后中性粒細(xì)胞吞噬活性 將分離好的中性粒細(xì)胞(3 ×106)加入激活素A(0～10 ng/ml)，37℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h。加紅色熒光微球(Microspheres，Red Fluoresent)，37℃孵育1 h 后洗去未被吞噬的紅色熒光微球，收集細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)吞噬百分率。

2 結(jié)果

2.1 分離小鼠腹腔中性粒細(xì)胞 迪夫快速染色結(jié)果顯示用此方法得到的中性粒細(xì)胞純度＞90%(圖1A)，對(duì)分離后的細(xì)胞用PE 標(biāo)記抗鼠Gr-1 與FITC標(biāo)記抗鼠CD3 抗體雙染，結(jié)果顯示Gr-1+細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)＞99%(圖1B)。

2.2 中性粒細(xì)胞表達(dá)ActRⅡA 免疫熒光染色結(jié)果顯示中性粒細(xì)胞可以同時(shí)表達(dá)Gr-1 與ActRⅡA(圖2A)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示中性粒細(xì)胞中Gr-1 與ActRⅡA 雙陽(yáng)性細(xì)胞為41.14%(圖2B)。

圖1 小鼠腹腔中性粒細(xì)胞的分離Fig.1 Isolation of peritoneal neutrophils in mouse

圖2 ActRⅡA 在中性粒細(xì)胞的表達(dá)Fig.2 Expression of ActRⅡA on mouse neutrophils

圖3 激活素A 對(duì)中性粒細(xì)胞激活素信號(hào)蛋白Smad3 表達(dá)的影響Fig.3 Effects of activin A on expression of Smad3 in mouse neutrophils

2.3 激活素A 對(duì)中性粒細(xì)胞激活素信號(hào)蛋白Smad3 表達(dá)的影響 如圖3 所示，激活素A 刺激后，中性粒細(xì)胞p-Smad3 表達(dá)上調(diào)，Smad3 蛋白表達(dá)有所下降，該結(jié)果進(jìn)一步表明，激活素A 可以作用于中性粒細(xì)胞并導(dǎo)致激活素信號(hào)傳導(dǎo)通路的活化。

圖4 激活素A 對(duì)中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)的影響Fig.4 Effects of activin A on respiratory burst

圖5 激活素A 對(duì)中性粒細(xì)胞NO 分泌及吞噬作用的影響Fig.5 Up-regulation of activin A on production of NO and phagocytosis of mouse neutrophils

2.4 激活素A 對(duì)中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)的影響 結(jié)果顯示，激活素A 可以增加中性粒細(xì)胞內(nèi)ROS(圖4A)及細(xì)胞外O2-的產(chǎn)生(圖4B)，該結(jié)果提示激活素A 可能通過(guò)激活中性粒細(xì)胞，增加中性粒細(xì)胞的耗氧量，產(chǎn)生呼吸爆發(fā)，提供中性粒細(xì)胞抗感染作用。

2.5 激活素A 促進(jìn)中性粒細(xì)胞NO 分泌及吞噬能力 如圖5 所示，不同濃度的激活素A 均可以促進(jìn)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NO，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示激活素A 可以明顯促進(jìn)中性粒細(xì)胞對(duì)紅色熒光微球的吞噬。

3 討論

激活素A 是重要的免疫調(diào)節(jié)因子，可由多種免疫細(xì)胞產(chǎn)生，并對(duì)多種免疫細(xì)胞功能具有調(diào)節(jié)作用，最近有研究顯示TNF-α 可以通過(guò)p38 MAPK 信號(hào)通路刺激中性粒細(xì)胞分泌大量激活素A［8］，然而，這些由中性粒細(xì)胞分泌的激活素A 是否可以作用于中性粒細(xì)胞目前尚不明確。激活素受體屬于絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)激酶型受體，分為激活素Ⅰ型受體(AcRⅠ)及激活素Ⅱ型受體(ActRⅡ)。激活素首先與ActRⅡ結(jié)合形成復(fù)合體，導(dǎo)致ActRⅡ變構(gòu)，激活A(yù)ctRⅠ，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)蛋白Smad 家族的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，將信號(hào)傳導(dǎo)入細(xì)胞核內(nèi)［9］。Smad 蛋白家族中的Smad2、3 可以介導(dǎo)TGF-β 和激活素的信號(hào)傳遞，磷酸化Smad3 對(duì)激活素信號(hào)傳導(dǎo)具有極其重要的作用［10，11］。本研究通過(guò)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色以及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，中性粒細(xì)胞標(biāo)志物Gr-1 和ActRⅡA 可以共表達(dá)于中性粒細(xì)胞表面，而且激活素A 刺激中性粒細(xì)胞后可以上調(diào)激活素信號(hào)傳導(dǎo)蛋白Smad3 磷酸化，上述資料充分證明，中性粒細(xì)胞不僅可以產(chǎn)生激活素A，同時(shí)也是激活素A 作用的靶細(xì)胞，激活素A 可能通過(guò)自分泌/旁分泌形式調(diào)控中性粒細(xì)胞活性。

激活素A 在一些主要由中性粒細(xì)胞參與的疾病中表達(dá)升高［12，13］，然而激活素A 是否可以調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞活性，目前仍無(wú)確切證據(jù)。我們的研究結(jié)果表明，激活素A 對(duì)中性粒細(xì)胞多種功能均有調(diào)節(jié)作用。呼吸爆發(fā)是中性粒細(xì)胞發(fā)揮其功能的重要機(jī)制，激活素A 可以增加中性粒細(xì)胞內(nèi)ROS 及細(xì)胞外O2-的產(chǎn)生，使中性粒細(xì)胞產(chǎn)生呼吸爆發(fā)。此外，激活素A 還具有刺激中性粒細(xì)胞分泌NO，增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的吞噬作用。

綜上所述，本研究證明激活素A 可以直接作用于中性粒細(xì)胞，并調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞多種功能，在中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥應(yīng)答中可能具有重要意義。

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