細菌生物膜對Th17 免疫細胞的刺激作用①

王國戧 王小方 汪 磊 張華麗 仲 華 潘亞晶 張 磊 婁婷葉

(新鄉醫學院第一附屬醫院檢驗科，衛輝 453100)

細菌生物膜是細菌在各種各樣的外界環境中形成的一種最普遍的結構，細菌生物膜形成是對外界環境壓力的一種反應，細菌形成生物膜后對外界的不利環境因素產生了抗性，包括對抗生素和宿主的免疫力［1］。細菌形成生物膜感染機體后引起感染的慢性化這一觀點已經形成廣泛共識［2-5］。關于細菌生物膜感染機體后引發的免疫反應目前報道的較少［6，7］，在這些少有的報道中，有文獻認為細菌生物膜感染刺激了Th17 細胞增殖和IL-17 細胞因子的表達增加［8-11］，但是也有報道稱生物膜并沒有引起機體明顯的免疫反應［12］，鑒于此，本研究的目的是研究生物膜形成能力和Th17 細胞的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗中所用菌株 實驗中所用的銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌來自于新鄉醫學院第一附屬醫院臨床肺泡灌洗液標本(細菌由肺泡灌洗液中培養分離)中第一代分離菌株(細菌在生長對數期時檢測生物膜形成能力)。

1.1.2 儀器和試劑 儀器:流式細胞儀為美國BD公司(FACS Canto)、酶免儀為煙臺艾德康公司生產全自動酶免疫工作站;試劑:Biolegend 公司人Th17流式檢測試劑盒:包括FITC 標記的抗人CD3，PE 標記的抗人CD4，Alexa Fluor 647 標記的抗人IL-7 及相匹配的鼠IgG1 同型對照，固定液和破膜洗液;Biolegend 公司CD4+CD25+Foxp3+Treg 一步法流式檢測試劑盒:包括FITC 標記的抗人CD4，PE 標記的抗人CD25，Alexa Fluor647 標記的Foxp3 及相匹配的鼠IgG1 同型對照，Foxp3+固定/破膜液和破膜緩沖液;佛波酯、離子霉素均購自Sigma 公司;莫能霉素購自Biolegend 公司;IL-17ELSIA 試劑盒為Biosource公司生產，結晶紫染液為自行配置。

1.2 實驗方法

1.2.1 IL-17 的檢測 臨床上無菌手續采集的肺泡灌洗液通過4 層無菌紗布過濾注入10 ml 的無菌試管中，2 000 r/min 離心5 min，上清液用于IL-17 的檢測，操作步驟嚴格按照說明書進行，離心沉淀用于細菌培養和Th17 細胞的檢測，2013 年1 月至2013年12 月共收到肺泡灌洗液標本253 例，另外檢測病人以及健康對照人群的外周血清IL-17 水平。

1.2.2 細菌培養與鑒定 上述離心后的肺泡灌洗液標本無菌手續取出少許用于細菌培養與鑒定，剩余標本用于Th17 細胞的檢測，沉淀標本接種于血瓊脂平板和麥康凱培養平板，次日將單個菌落用于細菌鑒定和生物膜形成能力的檢測(依據細菌菌落和細菌形態特點初步判斷銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌的菌落用于檢測生物膜形成能力，經鑒定后不是上述兩種細菌的生物膜形成能力檢測結果剔除)。

1.3 細菌生物膜形成能力的檢測 用結晶紫染色法［13］對臨床分離的鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌進行生物被膜生成能力檢測。具體方法如下:用細菌標準比濁管將鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌菌液調節至0.5 麥氏濁度，取10 μl 加入96 孔平底組織培養板中(每孔含200 μl 的1∶50 稀釋的LB 培養液)。每株菌作3 個復孔，一個空白對照孔只加培養液，37℃靜止培養48 h;每個菌的3 個復孔中分別加入150 μl 0.25 g/L 的結晶紫染液，室溫下染色20 min;生理鹽水沖洗5 次后晾干;每孔加入95%乙醇300 μl，室溫脫色10 min;用紫外可見分光光度計檢測每孔脫色液在570 nm 處的吸光度值(A570)。每個菌的A570 等于其3 個復孔的A570 的平均值減去空白對照孔A570 值。

1.4 Th17 細胞的檢測 Th17 細胞的檢測嚴格按照操作說明進行，檢測對象為上述培養出銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌的肺泡灌洗液標本以及上述病人的外周血以及24 例健康人外周血的Th17細胞。

1.5 數據統計 采用SPSS17.0 統計學軟件，所有數據均數均采用±s 表示，各組間均數差異統計采用獨立樣本t 檢驗和配對資料的t 檢驗，以P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細菌培養與鑒定結果 共分離培養出銅綠假單胞菌59 例，鮑曼不動桿菌54 例，這兩種細菌共計113 例。

2.2 細菌生物膜形成能力檢測結果 113 株細菌的生物被膜形成能力檢測結果為A570 值的最大分布范圍為:0.15～2.12，其中A570 值0.5 以下24株，A570 值1.5 以上28 份。在此本研究將A570 值0.5 以下的24 株細菌定為弱生物膜形成菌，感染此菌的病人定為非生物膜感染組，A570 值1.5 以上的28 株菌定為強生物膜形成菌，感染此菌的病人定為生物膜感染組。

2.3 生物膜感染組和非生物膜感染組Th17 細胞和IL-17 水平

2.3.1 不同實驗組外周血Th17 細胞和血清IL-17水平比較，見表1。

Th17 細胞三組之間比較P ＞0.05，分別為生物膜感染組對非生物膜感染組P=0.409，對健康對照組P=0.779，非生物膜感染組對健康對照P=0.598，血清IL-17 水平三組之間比較P ＞0.05，分別為生物膜感染組對非生物膜感染組P=0.138，對健康對照組P=0.136，非生物膜感染組對健康對照P=0.992。

2.3.2 不同實驗組支氣管灌洗液Th17 細胞和IL-17水平比較(±s)，見表2 以及流Th17 細胞式細胞圖(圖1)。

表1 不同實驗組外周血Th17 細胞和IL-17 水平比較(±s)Tab.1 Respective comparison of Th17 cell ratio and IL-17 level in peripheral blood in different experimentation groups(±s)

表1 不同實驗組外周血Th17 細胞和IL-17 水平比較(±s)Tab.1 Respective comparison of Th17 cell ratio and IL-17 level in peripheral blood in different experimentation groups(±s)

表2 不同實驗組支氣管灌洗液Th17 細胞和IL-17 水平比較(±s)Tab.2 Respective comparison of Th17 cell ratio and IL-17 level in bronchus alveolus washing-water between bio-film infection and Non bio-film infection group±s)

表2 不同實驗組支氣管灌洗液Th17 細胞和IL-17 水平比較(±s)Tab.2 Respective comparison of Th17 cell ratio and IL-17 level in bronchus alveolus washing-water between bio-film infection and Non bio-film infection group±s)

圖1 生物膜感染組與非生物膜感染組支氣管灌洗液中Th17 細胞流式細胞圖Fig.1 Flow cytometry pictures of Th17 cell in bronchoalveolar lavage fluid

3 討論

細菌生物膜是細菌在外界環境壓力下形成的一種普遍的結構，是對外界壓力的一種適應性反應。細菌形成生物膜后對外界的抗性增加，包括對抗生素的耐藥性和對機體的免疫逃避。報道認為細菌生物膜刺激機體并引起了機體的免疫反應，并引起感染機體的組織損害［8］，但也有報道認為細菌生物膜并沒有引起機體的免疫反應［12］，有報道認為細菌生物膜誘導了IL-6、IL-8 升高［2，14，15］，也有報道認為，浮游菌相對于生物膜細菌引起機體產生更多的IL-6、IL-8、血管內皮因子、TGF-β1，但生物膜細菌誘導機體產生了更多的TNF-α［16］。

Th17 細胞是新發現的隸屬于T 細胞的細胞系，在處理浮游菌細胞外感染中起關鍵作用，在慢性生物膜菌感染發生囊性纖維化或者支氣管擴張時Th17 細胞也可能起到了關鍵作用［17］，鑒于生物膜菌感染結果引起的不一致報道，我們的研究集中在了生物膜細菌感染引起的Th17 細胞的變化。

我們的研究結果表明，生物膜感染主要引起了感染局部Th17 細胞的變化，并沒有引起全身系統性的免疫變化，局部Th17 細胞的聚集，Th17 細胞通過分泌細胞趨化因子引起更多的中性粒細胞到達感染部位［17］，中性粒細胞在殺死感染細菌的同時也引起了感染機體組織的損傷，另一方面細菌生物膜的存在導致細菌的多重耐藥［18］和對機體免疫力的抵抗［19］，這可能是細菌形成生物膜后引起感染慢性化的機制，從而導致了感染機體的長期慢性損害。所以對于生物膜細菌感染機體適當地降低免疫反應有利于減輕感染局部的炎癥損害。關于細菌生物膜引起Th17 細胞增殖的機制，我們沒有檢索到相關文獻，這方面的機制我們研究小組正繼續努力通過生物膜的主要成分分別研究。

［1］Sadowska B，Wickowska-Szakiel M，Paszkiewicz M，et al.The immunomodulatory activity of Staphylococcus aureus products derived from biofilm and planktonic cultures［J］.Arch Immunol Ther Exp(Warsz)，2013，61(5):413-420.

［2］Cantero D，Cooksley C，Bassiouni A，et al.Staphylococcus aureus biofilm activates the nucleotide-binding oligomerization domain containing 2 (Nod2)pathway and proinflammatory factors on a human sinonasal explant model［J］.Int Forum Allergy Rhinol，2013，3(11):877-884.

［3］Peyyala R，Kirakodu SS，Novak KF，et al.Oral microbial biofilm stimulation of epithelial cell responses［J］.Cytokine，2012 Apr;58(1):65-72.

［4］Prabhakara R，Harro JM，Leid JG，et al.Suppression of the inflammatory immune response prevents the development of chronic biofilm infection due to methicillin-resistant Staphylococcus aureus［J］.Infect Immun，2011，79(12):5010-5018.

［5］Moutsopoulos NM，Kling HM，Angelov N，et al.Porphyromonas gingivalis promotes Th17 inducing pathways in chronic periodontitis［J］.J Autoimmun，2012，39(4):294-303.

［6］Granslo HN，Klingenberg C，Fredheim EA，et al.Staphylococcus epidermidis biofilms induce lower complement activation in neonates as compared with adults［J］.Pediatr Res，2013，73(3):294-300.

［7］Sun Y，Zhou B，Wang C，et al.Biofilm formation and Toll-like receptor 2，Toll-like receptor 4，and NF-kappaB expression in sinus tissues of patients with chronic rhinosinusitis［J］.Am J Rhinol Allergy，2012，26(2):104-109.

［8］Prabhakara R，Harro JM，Leid JG，et al.Murine immune response to a chronic Staphylococcus aureus biofilm infection［J］.Infect Immun，2011，79(4):1789-1796.

［9］Snowden JN，Beaver M，Smeltzer MS，et al.Biofilm-infected intracerebroventricular shunts elicit inflammation within the central nervous system［J］.Infect Immun，2012，80(9):3206-3214.

［10］Cheng WC，Hughes FJ，Taams LS.The presence，function and regulation of IL-17 and Th17 cells in periodontitis［J］.J Clin Periodontol，2014，41:541-549.

［11］Ohlrich EJ，Cullinan MP，Seymour GJ.The immunopathogenesis of periodontal disease［J］.Aust Dent J，2009，54(Suppl 1):S2-S10.

［12］Wood AJ，Fraser JD，Swift S，et al.Intramucosal bacterial microcolonies exist in chronic rhinosinusitis without inducing a local immune response［J］.Am J Rhinol Allergy，2012，26 (4):265-270.

［13］楊維青，劉曉峰，黃 震.銅綠假單胞茵臨床菌株生物被膜的定量分析［J］.中國抗生素雜志，2009，34(3):181-183.

［14］Cantero D，Cooksley C，Jardeleza C，et al.A human nasal explant model to study Staphylococcus aureus biofilm in vitro［J］.Int Forum Allergy Rhinol，2013，3(7):556-562.

［15］Eberhard J，Pietschmann R，Falk W，et al.The immune response of oral epithelial cells induced by single-species and complex naturally formed biofilms［J］.Oral Microbiol Immunol，2009，24(4):325-330.

［16］Kirker KR，James GA，Fleckman P，et al.Differential effects of planktonic and biofilm MRSA on human fibroblasts［J］.Wound Repair Regen，2012，20(2):253-261.

［17］Aujla SJ，Dubin PJ，Kolls JK.Th17 cells and mucosal host defense.Semin Immunol，2007，19(6):377-382.

［18］Pradeep Kumar SS，Easwer HV，Maya Nandkumar A.Multiple drug resistant bacterial biofilms on implanted catheters -a reservoir of infection［J］.Assoc Physicians India，2013，61(10):702-707.

［19］Alhede M，Bjarnsholt T，Givskov M，et al.Pseudomonas aeruginosa biofilms:mechanisms of immune evasion［J］.Adv Appl Microbiol，2014;86:1-40.