兩種免疫調(diào)節(jié)劑增強弓形蟲W2b2a 表位疫苗的小鼠保護作用①

謝榮華 譚 逵 吳 翔 舒衡平 (湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學院，衡陽 421005)

弓形蟲是一種人畜共患胞內(nèi)寄生的機會致病性原蟲，能感染人類及溫血動物，引起人獸共患弓形蟲病，目前尚無理想的藥物治療弓形蟲病，研究弓形蟲疫苗預防弓形蟲病是目前此領(lǐng)域的熱點。弓形蟲疫苗有單表位和多表位疫苗，是利用基因重組技術(shù)將一個或者多個弓形蟲抗原表位的編碼基因連接在一起制成的疫苗，但單用弓形蟲疫苗的保護性效果不太理想，可用免疫調(diào)節(jié)劑來增強弓形蟲疫苗的免疫原性，產(chǎn)生更有效和持久的保護性免疫。本研究組在前期已成功構(gòu)建了弓形蟲W2b2a 表位疫苗質(zhì)粒，能夠誘導小鼠產(chǎn)生抗弓形蟲感染的保護性免疫［1］。匹多莫德(Pidotimod)化學名為(R)-3-［(S)-(5-氧-2-吡咯烷基)羰基］-噻唑烷基-4-甲酸，由焦谷氨酸和四氫噻唑羧酸兩個氨基酸組成的二肽，是一種全新的化學合成免疫調(diào)節(jié)劑，既能促進非特異性免疫反應又能促進特異性免疫反應［2］。沙利度胺(Thalidomid)化學名為3-鄰苯二甲酰亞胺基戊二酰亞胺，這是一個老藥新用的免疫調(diào)節(jié)劑，它能特異的調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子(TNF)-α 的水平。本文探討匹多莫德、沙利度胺免疫調(diào)節(jié)劑能否增強弓形蟲W2b2a 表位疫苗刺激機體產(chǎn)生免疫應答和保護免疫的效果。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒 弓形蟲RH 株為本室傳代保種、pcDNA3、pcDNA3-W2b2a 為本室構(gòu)建。

1.2 實驗動物 清潔級昆明小鼠，6 周齡左右，雌雄各半，體重為(20±2)g，購自南華大學實驗動物中心。

1.3 主要試劑與藥物 HRP 標記的羊抗小鼠IgG購自北京博大泰克公司，F(xiàn)ITC-CD4、PE-CD8a 為Bioscience 公司產(chǎn)品;IFN-γ 檢測ELISA 試劑盒購自深圳晶美生物有限公司;細胞增殖-毒性檢測試劑盒(CCK-8)購自上海美季生物技術(shù)有限公司;FREUND 佐劑購自Sigma 公司;匹多莫德為太陽石(唐山)藥業(yè)有限公司產(chǎn)品;沙利度胺片，25 mg/片，國藥準字H32026129，常州制藥廠有限公司。

1.4 實驗動物分組及動物免疫 昆明小鼠120 只，隨機分為6 組，雌雄各半，分別為Ⅰ組:pcDNA3-W2b2a 質(zhì)粒100 μl、Ⅱ組:pcDNA3-W2b2a 質(zhì)粒100 μl 加匹多莫德(200 mg/kg/d)、Ⅲ組:pcDNA3-W2b2a 質(zhì)粒100 μl 加沙利度胺(1.0 mg/只/d)、Ⅳ組:pcDNA3-W2b2a 質(zhì)粒100 μl 加弗氏佐劑組、Ⅴ組:pcDNA3 100 μl、Ⅵ組:生理鹽水100 μl。將定量的匹多莫德、沙利度胺、弗氏佐劑分別與pcDNA3-W2b2a 質(zhì)粒混合，從小鼠左后腿肌肉注射，每次100 μl，共免疫3 次，每次間隔2 周，生理鹽水組和pcDNA3 組作對照。分別于免疫前及末次免疫后第2周、第4 周用斷尾法收集小鼠血清備用。

1.5 小鼠血清特異性抗體IgG 檢測 按試劑盒操作說明檢測各組免疫前及末次免疫后第2 周、第4周免疫鼠血清抗體IgG 水平。

1.6 小鼠血清IFN-γ 測定 小鼠末次免疫后2 周取血清測定IFN-γ，測定方法按試劑盒說明操作。

1.7 小鼠脾細胞懸液制備 小鼠末次免疫后2 周，在攻擊實驗前，每組小鼠隨機處死8 只無菌取脾臟置于200 目銅網(wǎng)，研磨后用1640 培養(yǎng)液沖洗，收集脾細胞，破紅細胞后，用含10%小牛血清的1640 培養(yǎng)液吹打混勻，將脾細胞數(shù)調(diào)整至5 ×106ml-1，用于測定鼠脾細胞T 淋巴細胞亞群。

1.8 鼠脾細胞T 淋巴細胞亞群測定 PBS 調(diào)整小鼠脾細胞懸液密度至(1.6～1.9)×106個/ml 于BD公司專用試管中，每只小鼠設(shè)兩管，1 500 r/min 離心5 min，吸取900 μl 上清;加PE-CD8α、FITC-CD4、PE-Cy5-CD3e 單抗各5 μl，混勻10 s，室溫避光放置30 min，1 500 r/min 離心5 min，棄上清，每管加入2 ml PBS 溶液，混勻10 s，1 500 r/min 離心5 min，棄上清;用PBS 溶液洗滌一次;加1%多聚甲醛100 μl，混勻10 s，在BD FACSCalibur 流式細胞儀上用CELLQuest 軟件獲取CD4+、CD8+T 淋巴細胞數(shù)量，并計算CD4+T 淋巴細胞與CD8+T 淋巴細胞比值。

1.9 免疫鼠脾細胞增殖實驗(CCK-8 法) 將各組脾細胞懸液100 μl(2 ×104ml-1)分別加入96 孔細胞培養(yǎng)板(每組設(shè)2 個復孔和對照孔)，各組分別加入ConA，(終濃度為10 μg/ml)對照孔加入ConA，37℃，5%CO2培養(yǎng)48 h。于培養(yǎng)結(jié)束前4 h 各孔加入10 μl CCK-8 試劑。培養(yǎng)結(jié)束后，吸去100 μl 上清，測定時每孔加入二甲亞砜(DMSO)100 μl，振蕩溶解，用酶標儀測定吸光度(A450 值)。

1.10 攻擊感染實驗 末次免疫后第4 周，實驗組和對照組小鼠經(jīng)腹腔注射弓形蟲RH 株速殖子(500個/鼠)，觀察記錄小鼠的感染情況和死亡時間。

1.11 統(tǒng)計學處理 統(tǒng)計數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計軟件SPSS11.5 非參數(shù)Kruskal-Wallis 檢驗。以±s 表示，表格采用Excel 制圖。

2 結(jié)果

2.1 小鼠血清特異性IgG 抗體水平 各免疫組小鼠特異性IgG 抗體均高于對照組(P ＜0.05)，且均于末次免疫后第4 周達到最高值;Ⅱ組pcDNA3-W2b2a 加匹多莫德組、Ⅳ組pcDNA3-W2b2a 加弗氏佐劑組IgG 抗體水平較Ⅰ組pcDNA3-W2b2a 組和Ⅲ組pcDNA3-W2b2a 加沙利度胺組同期要高(P ＜0.05)(圖1)。

2.2 免疫小鼠血清IFN-γ 檢測 按試劑盒提供的IFN-γ 標準品所測OD 值繪制標準曲線，將所測得的小鼠血清OD 值換算成IFN-γ 濃度(pg/ml)(表1)，Ⅱ組pcDNA3-W2b2a 加匹多莫德、Ⅳ組pcDNA3-W2b2a 加弗氏佐劑、Ⅲ組pcDNA3-W2b2a 加沙利度胺小鼠血清IFN-γ 水平明顯高于pcDNA3-W2b2a 組和對照組(P ＜0.01)。

圖1 ELISA 法檢測小鼠血清IgG 的結(jié)果Fig.1 Detection of IgG in sera of mice by ELISA

表1 小鼠血清IFN-γ 濃度(pg/ml)、鼠脾細胞亞群檢測(%)Tab.1 Detection of concentration of cytokine IFN-γ in serum and leukomonocyte subpopulation of splenoctes from immunized mice

表2 速殖子攻擊后各組小鼠存活時間(±s)Tab.2 Survival time of mice in different groups after challenged with tachyzoite(±s)

表2 速殖子攻擊后各組小鼠存活時間(±s)Tab.2 Survival time of mice in different groups after challenged with tachyzoite(±s)

Note:Ⅰ.pcDNA3-W2b2a;Ⅱ.pcDNA3-W2b2a and Pidotimod;Ⅲ.pcDNA3-W2b2a and Thalidomid;Ⅳ.pcDNA3-W2b2a and Freund adjuvant;V.pcDNA3;Ⅵ.Nacl;1)compared with control groups，P ＜0.01.

圖2 速殖子攻擊后各組小鼠存活率Fig.2 Survival rate of mice in different groups after challenged with tachyzoite

2.3 鼠脾細胞T 淋巴細胞亞群測定 小鼠末次免疫后第2 周，取小鼠脾細胞進行T 淋巴細胞亞群測定，pcDNA3-W2b2a 組、pcDNA3-W2b2a 加匹多莫德組、pcDNA3-W2b2a 加沙利度胺組、pcDNA3-W2b2a加弗氏佐劑組與對照組比較CD4+T、CD8+T 淋巴細胞數(shù)量增多;pcDNA3-W2b2a 加匹多莫德組、pcDNA3-W2b2a 加弗氏佐劑組CD4+/CD8+比值明顯高于pcDNA3-W2b2a 組和pcDNA3-W2b2a 加沙利度胺組(表1)。

2.4 免疫鼠脾細胞增殖實驗(CCK-8) 末次免疫后二周，ConA 刺激小鼠脾T 細胞，免疫組小鼠脾細胞均發(fā)生增殖。各組脾細胞增殖活性如下(加ConA孔的A 值與不加ConA 孔的A 值的比值):pcDNA3-W2b2a:1.12，pcDNA3-W2b2a 加匹多莫德組:1.98，pcDNA3-W2b2a 加沙利度胺:1.34，pcDNA3-W2b2a加弗氏佐劑:2.03，各免疫組脾淋巴細胞增殖能力與兩對照組比較明顯增強(P ＜0.05)。

2.5 抗攻擊感染的免疫保護作用 末次免疫后第四周每只小鼠經(jīng)腹腔注射500 個弓形蟲速殖子，實驗小鼠均不能耐受弓形蟲攻擊感染。疫苗組小鼠存活時間明顯長于pcDNA3 組及生理鹽水組(P ＜0.05)，且pcDNA3-W2b2a 加匹多莫德組、pcDNA3-W2b2a 加弗氏佐劑組小鼠存活時間長于pcDNA3-W2b2a 組和pcDNA3-W2b2a 加沙利度胺組(P ＜0.05)，說明匹多莫德能增強弓形蟲W2b2a 表位疫苗抗弓形蟲感染的免疫力(表2，圖2)。

3 討論

免疫調(diào)節(jié)劑匹多莫德是一種安全有效的生物反應調(diào)節(jié)劑，既能促進非特異性免疫反應又能促進特異性免疫反應［2］。動物和人體試驗均表明，本品具有良好的安全性和耐受性，克服了生物來源免疫調(diào)節(jié)劑的不良反應。王為為等［3］研究匹多莫德能夠顯著激活地塞米松誘導的免疫抑制，抑制地塞米松誘導的小鼠弓形蟲隱性感染活化，其免疫調(diào)節(jié)機制有Th1 和Treg 細胞的參與;國外，Tan 等［4］研究口服匹多莫德對正常和免疫功能低下的小鼠的免疫功能有明顯的增強作用，使免疫功能低下時降低的輔助性T 細胞(CD4+)與抑制性T 細胞(CD8+)的比值恢復正常;謝榮華［5］研究證實匹多莫德可增強弓形蟲GRA1 蛋白抗弓形蟲感染的免疫效果;趙瑩等［6］報道匹多莫德具有一定的體外抑制弓形蟲速殖子增殖的作用，匹多莫德與磺胺甲惡唑聯(lián)合應用既能降低磺胺甲惡唑用量又能有效抑蟲。沙利度胺是一種合成谷氨酸衍生物，曾名反應停，具有鎮(zhèn)靜、止吐的作用，后發(fā)現(xiàn)該藥有強烈致畸而被禁用。2006 年又被批準用于與地塞米松聯(lián)合治療多發(fā)性骨髓瘤。沙利度胺對多種腫瘤都具有抗血管生成作用，但因其具有過多的不良反應，限制了其長期應用。研究者通過對其化學結(jié)構(gòu)進行改造，開發(fā)了新一代的沙利度胺類似物pomalidomide 具有T 細胞共同刺激作用，激活T 細胞特異性免疫反應［7］;沙利度胺可以刺激細胞毒性T 細胞增殖，誘導其分泌具有直接抗腫瘤作用的干擾素γ (IFN-γ)和IL-2［8］。對于沙利度胺的研究還在繼續(xù)，隨著研究的深入，幾乎無致畸性的沙利度胺衍生物將會面世。

表位疫苗已在寄生蟲疫苗的研究中獲得滿意的免疫效果［9］，本課題組在前期成功構(gòu)建弓形蟲多表位疫苗pcDNA3-W2b2a 并證實誘導小鼠產(chǎn)生一定的抗弓形蟲感染的作用［1］，本次研究結(jié)果顯示:pcDNA3-W2b2a 加匹多莫德組、pcDNA3-W2b2a 加弗氏佐劑組、pcDNA3-W2b2a 加沙利度胺組小鼠血清IFN-γ 水平顯著高于pcDNA3-W2b2a 組。pcDNA3-W2b2a 加匹多莫德組、pcDNA3-W2b2a 加弗氏佐劑組IgG 抗體水平、CD4+/CD8+比值、T 細胞增殖活性顯著高于pcDNA3-W2b2a 質(zhì)粒組和pcDNA3-W2b2a 加沙利度胺組，免疫組抗體水平均在末次免疫后第四周最高。小鼠攻擊試驗表明，免疫組小鼠存活時間明顯長于對照組(P ＜0.05)，且pcDNA3-W2b2a 加匹多莫德組、pcDNA3-W2b2a 加弗氏佐劑組小鼠存活時間長于其他免疫組。匹多莫德、沙利度胺與弗氏佐劑可增強弓形蟲新基因W2b2a 表位疫苗免疫小鼠的保護作用。其中匹多莫德作用接近于弗氏佐劑，但副作用顯著低于后者，可望用于弓形蟲亞單位疫苗的研制。

［1］譚 逵，張 瓊，范久波，等.弓形蟲新基因wx2 表位疫苗免疫小鼠的保護研究［J］.中國病原生物學雜志，2008，35(9):1051-1058.

［2］田新平，曾小峰.新型合成免疫調(diào)節(jié)劑匹多莫德［J］.中國新藥雜志，2005，14(1):111-114.

［3］王為為，霍星星，孔蘭婷，等.匹多莫德抑制地塞米松誘導的小鼠隱性弓形蟲感染的活化［J］.中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志，2013，31(5):385-389.

［4］Tan HR，Dong Q，Cao LZ，et al.The effect of immune-potentiating action and expressing lymphocyte factor of pidotimod［J］.J Beijing Med Univ，1999，31(2):38-41.

［5］謝榮華.匹多莫德增強弓形蟲GRA1 蛋白免疫效果的動物實驗評價［J］.中國免疫學雜志，2011，27(8):748-750.

［6］趙 瑩，呂芳麗.匹多莫德體外抑制弓形蟲增殖作用的研究［J］.熱帶醫(yī)學雜志，2013，13(5):531-534.

［7］Dredge K，Marriott JB，Todryk SM，et al.Protective antitumor immunity induced by a costimulatory thalidomide analog in conjunction with whole tumor cell vaccination is mediated by increased Th1-type immunity［J］.Immunol，2002，168(10):4914-4919.

［8］任巖松，沈舜義.老藥新用在新藥研發(fā)中的意義［J］.世界臨床藥物，2013，34 (11):687-691.

［9］范久波，吳 翔，譚 逵，等.弓形蟲新基因表位疫苗效果的觀察［J］.中國病原生物學雜志，2008，3(6):421-424.