H7N9 流感病毒HA、NA 蛋白的抗原表位預測及其與HLA-Ⅱ類等位基因的相關性分析①

劉雪婷 王 珊 張俊艷 劉兆宇 陳惠芳 鄒澤紅 肖蘭艷 及志恒 何 穎 (廣州醫科大學附屬第二醫院 廣東省過敏反應與免疫重點實驗室/呼吸疾病國家重點實驗室變態反應研究室，廣州 510260)

甲型H7N9 流感病毒是在2013 年3 月在中國東部上海和安徽兩地率先發現的一種新型禽流感病毒［1］，感染該病毒將引起肺炎、呼吸道衰竭、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)［2］。截止到2014 年6 月11日，全國共報告感染H7N9 禽流感的患者共有434例，其中有165 人死亡，死亡率達38%。

甲型流感病毒顆粒外膜由兩型表面糖蛋白覆蓋，一型為血細胞凝集素(Hemagglutinin，HA)，一型為神經氨酸酶(Neuraminidase，NA)。HA 蛋白的裂解性、受體特異性和糖基化是決定流感病毒感染性和致病性的重要因素。NA 蛋白在決定病毒毒力和宿主特異性方面也具有重要作用，與HA 共同成為流感病毒亞型分型的主要依據，NA 同時也是抗流感病毒的重要作用靶點［3］。甲型流感能不斷引起流行是由于其抗原性不斷發生漂移，使流感病毒逃過人體免疫系統的識別［4］，其中最重要是HA 和NA的變異［5］，因此可以通過針對HA 和NA 的表位疫苗技術來解決這一問題。表位預測是表位疫苗設計的前提，本研究采用生物信息學方法，分析了H7N9流感病毒的28 種HA、24 種NA 的氨基酸序列的同源性，預測HA 和NA 蛋白的T 細胞和B 細胞相關抗原表位，為新型H7N9 流感疫苗的制備提供依據。

人類白細胞抗原(HLA)是位于人類第6 號染色體短臂上的一組緊密連鎖的基因群，是目前已知人體中最具多態性的遺傳系統［6］。HLA 系統在不同民族種族和地區間分布不同，是機體對疾病易感的主要遺傳成分，即擁有不同的HLA 等位基因是導致個體間免疫應答能力和對疾病易感性出現差異的主要遺傳學原因［6］。同時，HLA 是人體特異性免疫系統的一道重要屏障，HLA 分子提呈侵入人體的抗原呈遞給T 細胞，進行抗原清除。HLA 和T 細胞及相關細胞因子在介導病毒感染人體中發揮極其重要的作用［7］。本研究預測HLA-DRB1* 0701 等位基因與HA 和NA 有較強結合力，并根據數據庫和文獻公布的該基因在不同地域人群中的基因頻率，推測對H7N9 病毒敏感的人群，以便更有效、及時地控制H7N9 流感的傳播。

1 材料與方法

1.1 HA 和NA 氨基酸序列的獲得及同源性分析從NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/)網站下載甲型H7N9 流感病毒的28 種HA 和24 種NA 的氨基酸序列，用ClustalX 軟件進行多序列比對，用MEGA4.0 的鄰接法(Neighbor-joining method，NJ)構建進化樹。根據序列比對分析結果，選取其中HA、NA 蛋白代表性的序列作為基準序列，用于后續的B 細胞抗原表位、T 細胞抗原表位預測以及對H7N9 易感人群的預測。

1.2 HA 和NA 蛋白的B 細胞抗原表位預測 應用DNAStar 軟件中的Protean 模塊分析HA、NA 蛋白的基準序列，根據Kyte-Doolittle 方案預測其親水性［8］;根據Karplus-Schulz 方案預測其柔韌性;根據Emini 方案預測其表面可及性［9］;根據Jameson-Wolf 方案預測其抗原性指數［10］，確定HA 和NA蛋白基準序列的B 細胞抗原表位。選取親水性高、柔韌性好、表面可及性大、抗原性指數高的區域作為候選表位，并兼顧二級結構各參數，避開α-螺旋和β-折疊區域，確定HA、NA 蛋白的B 細胞優勢抗原表位。

1.3 HA 和NA 蛋白的T 細胞抗原表位預測 使用NetMHC Ⅱ2.2 Server 在線服務器(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCII/)分析26 種MHCⅡ類分子(包括14 種HLA-DR、6 種HLA-DP 和6 種HLA-DQ 等位基因型)與H7N9 流感病毒HA、NA 蛋白的滑動九肽的結合情況。滑動9 肽的選取方法為:第1～9 氨基酸序列對應的肽段為第1 個九肽，第2～10 氨基酸序列對應的肽段為第2 個九肽，第3～11 氨基酸對應的肽段為第3 個九肽，以此類推。滑動九肽與HLA 高親和力的閾值為0.64，低親和力的閾值為0.42。與26 種MHCⅡ類分子結合力大于0.42 的九肽對應的氨基酸序列視為是潛在的T抗原表位。

1.4 H7N9 流感病毒與HLA 等位基因相關性分析及易感人群預測 利用NetMHCⅡ2.2 Server 在線軟件分析HA、NA 蛋白的滑動九肽與26 種HLA-Ⅱ類分子的結合情況，篩選出與HA、NA 蛋白的滑動九肽具有高親和力(親和指數大于0.64)的HLA-Ⅱ類分子等位基因型，攜帶這些HLA 等位基因的人群可能是對H7N9 病毒存在高的免疫反應性的易感人群。

從等位基因頻率數據庫(http://www.allele-frequencies.net/)查詢與HA、NA 蛋白具有高親和力的HLA 等位基因在亞洲不同國家的基因頻率，并通過文獻驗證，根據HLA 等位基因頻率推測H7N9 流感病毒更有可能在哪些國家爆發。

2 結果

2.1 HA、NA 蛋白的氨基酸比較 經過進化樹分析發現，不同甲型H7N9 流感病毒株之間氨基酸序列相對保守，且28 種HA 以及24 種NA 氨基酸序列可以分為兩個大的族群(圖1A、B)。分別選取兩種蛋白的兩個族群中較有代表性的HA 氨基酸序列ABI84694.1 與AEK84761.1 和NA 氨基酸序列AFX85263.1 與AFU25736.1 為基準序列以便進行下一步的細胞抗原性表位預測。

圖1 H7N9 流感病毒HA、NA 蛋白的同源性分析Fig.1 Phylogenetic tree of HA and NA proteins in novel avian-origin influenza A (H7N9)virus

圖2 HA、NA 蛋白的B 細胞表位預測Fig.2 Prediction of B cell epitopes on HA and NA proteins of novel avian-origin influenza A (H7N9)virus

2.2 HA、NA 蛋白的基準序列的B 細胞抗原性預測 經分析發現，HA 氨基酸序列ABI84694.1 與AEK84761.1 的B 細胞表位預測結果并沒有明顯差別，同 樣，NA 氨 基 酸 序 列 AFX85263.1 與AFU25736.1 的B 細胞表位預測結果也沒有明顯差別，因此只選取HA 氨基酸序列ABI84694.1 和NA 氨基酸序列AFX85263.1的結果列出。通過DNAStar軟件的Protean 模塊對HA 和NA 蛋白的親水性、柔韌性、表面可及性、抗原性指數進行預測。取親水性高、柔韌性好、表面可及性大、抗原性指數高的區域，綜合選取至少2 個上述參數較好的重疊區域，并兼顧二級結構預測結果，選取無規卷曲區域，獲得B細胞的抗原表位區域。從圖2A 綜合各參數分析，發現在HA 蛋白中63-70、98-117、173-185、195-207、217-238、306-322、332-341、363-429、443-475、492-512 各項指數均較高，提示可能是抗原性表位;從圖2B 綜合各參數分析，發現在NA 蛋白中1-9、57-60、97-105、137-141、143-150、162-168、210-215、219-222、258-263、273-280、310-323、415-425 各項指數均較高，提示為抗原性表位。

圖3 H7N9 流感病毒HA、NA 蛋白的T 細胞表位預測Fig.3 Prediction of T cell epitopes on HA and NA proteins of novel avian-origin influenza A (H7N9)virus

2.3 HA、NA 蛋白基準序列的T 細胞抗原性預測 使用NetMHCⅡ2.2 Server 在線軟件預測了基準株HA(ABI84694.1)、NA(AFX85263.1)蛋白的HA、NA 蛋白的滑動九肽與26 種HLA-Ⅱ類分子結合力，結合力大于0.42 的滑動九肽對應的氨基酸序列為T 抗原表位。軟件預測結果顯示，HA 蛋白中第13、24-29、87-89、116、133-183、202-204、225、241-268、290-303、317-324、338-341、377、401-438、510、527-546 滑動九肽對應的氨基酸區段與26 種HLA-Ⅱ類分子結合力較高(圖3A);NA 蛋白中第7、61-67、92、132-133、156、244-262、310、375-377、420-438 滑動九肽對應的氨基酸區域與26 種HLA-Ⅱ類分子結合力較高(圖3B)，可能為T 細胞抗原性表位。

2.4 H7N9 流感病毒與HLA 等位基因相關性分析及易感人群預測 根據NetMHCⅡ2.2 Server 在線軟件預測的HA、NA 蛋白的滑動九肽與26 種HLA-Ⅱ類分子結合情況，我們篩選出與HA 蛋白的多個滑動九肽具有高親和力的HLA 等位基因DRB1*0701、DQA1 * 0501-DQB1 * 0301、DPA1 * 0103-(DPB1* 0301/DPB1* 0401)(表1)以及與NA 蛋白的多個滑動九肽具有高親和力的HLA 等位基因DRB1* 0701、DRB1* 0101(表2)，攜帶這些等位基因型的人群可能是H7N9 流感病毒的易感人群，尤其是DRB1* 0701 等位基因，與HA、NA 蛋白的多個滑動九肽具有高親和力。

根據HLA 等位基因頻率數據庫的查詢結果，結合文獻驗證，我們發現DRB1* 0701 在烏魯木齊維吾爾族人群基因頻率為16.7%，在哈爾濱滿族人群基因頻率為12.8%，在山東漢族人群基因頻率為11.2%，在遼寧漢族人群基因頻率為10.7%，在北京、石家莊、天津漢族人群基因頻率為9.5%，均屬于高頻率等位基因型，提示H7N9病毒在這些地區的危險性較高;在中國廣東、云南、臺灣地區漢族人群基因頻率分別為5.7%、4.1%、2.8%;在日本、韓國人群中的基因頻率分別為6.7%、0.3%(表3)。

表1 HA 蛋白的滑動九肽與HLA-Ⅱ等位基因的結合情況分析Tab.1 Analysis of affinity between peptides of HA protein and HLA-Ⅱalleles by NetMHCⅡ2.2 Server

表2 NA 蛋白的滑動九肽與HLA-Ⅱ等位基因的結合情況分析Tab.2 Analysis of affinity between peptides of NA protein and HLA-Ⅱalleles by NetMHCⅡ2.2 .Server

表3 DRB1* 0701 在亞洲不同地區的頻率Tab.3 Frequency of DRB1* 0701 in different countries in Asia

3 討論

近年來隨著生物信息技術的快速發展，生物信息學軟件已成為預測抗原表位的有力工具。國內外不少學者都在生物信息學方法預測的基礎上進行抗原表位的研究。通過生物信息學軟件的預測可極大地提高表位篩選的成功率，減少實驗工作量，節省研究時間。

理想的抗原表位最好能兼有B 細胞表位與T細胞表位的功能［28］。一方面可以通過刺激B 細胞產生針對抗原的特異性抗體，直接與病毒結合。同時又可以與MHCⅡ類分子結合，遞呈到抗原遞呈細胞表面，引發T 細胞的活化，產生獲得性免疫應答并能為B 細胞產生抗體提供幫助。本研究利用軟件對H7N9 流感病毒的HA、NA 蛋白的基準序列的B 細胞和T 細胞抗原表位進行預測，HA 具有10 個B 細胞表位和15 個T 細胞表位;NA 有12 個B 細胞表位和9 個T 細胞表位，可以作為檢測以及疫苗研發的靶區域。但是細胞抗原性表位預測仍然不夠完善，目前幾乎所有的細胞抗原性表位預測的算法都是預測連續氨基酸組成的線性表位，而較少涉及構象性表位的研究。本研究僅是對新型H7N9 流感病毒的HA 和NA 蛋白的細胞抗原性表位進行初步篩選，預測結果需要進一步用實驗結果來證實。

HLA 的Ⅰ類和Ⅱ類基因在人類基因組中多態性最為豐富，其產物主要具有提呈抗原、激活效應T細胞的功能。它們本身多形異質型以及參與免疫應答，因此具有HLA-Ⅱ某些基因的人群對某些免疫疾病有易感性［29］。影響HLA 基因易感性的因素很多，包括種族的不同和地域的差異。本研究利用NetMHCⅡ2.2 Server 軟件分析與H7N9 流感病毒的HA、NA 蛋白具有高親和力的HLA 等位基因為DRB1* 0701，并根據該基因在亞洲不同國家的基因頻率，預測H7N9 病毒可能的易感人群。

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