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響應(yīng)面法優(yōu)化黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖條件

2015-03-19 06:44:56宗希明史偉國王麗紅
安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年33期
關(guān)鍵詞:黑木耳

李 洋,宗希明,袁 寰,史偉國,李 野,王麗紅,杜 娟,周 彤

(佳木斯大學(xué)藥學(xué)院,黑龍江佳木斯154002)

黑木耳(Auricularia auricular)屬于擔(dān)子菌綱、木耳目、木耳科、木耳屬,是一種藥食同源的真菌類物質(zhì)[1]。黑木耳含有多種成分,多糖為其重要活性成分,研究表明,黑木耳多糖具有抗衰老[2]、抗凝血[3-4]、降血糖[5]、降血脂[6]、抗腫瘤[7]、增加免疫等功能[8-9]。食用菌深層發(fā)酵技術(shù)其特點為生產(chǎn)周期短、產(chǎn)量大、質(zhì)量高、經(jīng)濟(jì)效益突出等,在液體菌種制備、醫(yī)藥及保健、食品行業(yè)以及抑菌防腐等領(lǐng)域具有廣泛用途[10]。筆者將水果皮、中藥材等考察因素加入到培養(yǎng)基中進(jìn)行試驗,并應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖的條件,應(yīng)用苯酚-硫酸法對黑木耳菌液體發(fā)酵的胞外多糖含量進(jìn)行測量,對液體發(fā)酵黑木耳菌胞外多糖具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種。供試黑木耳菌由佳木斯大學(xué)生命科學(xué)院提供。

1.1.2 培養(yǎng)基。PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯20%,瓊脂3%,葡萄糖2%,pH自然。液體發(fā)酵培養(yǎng)基:馬鈴薯汁20%,KH2PO40.30%,MgSO4·7H2O 0.15%,VB10.01%,碳源 3%,氮源0.15%,水果皮4%,中藥材10%,pH自然。

1.2 方法

1.2.1 PDA培養(yǎng)。從斜面培養(yǎng)基中取出菌絲塊接種于PDA平板培養(yǎng)基中部,放置到26℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每天觀察菌絲體的生長狀況,及時淘汰感染雜菌的培養(yǎng)基。

1.2.2 液體發(fā)酵單因素試驗。根據(jù)單因素試驗對液體培養(yǎng)基進(jìn)行配制并編號。無菌操作臺上取出1 cm2的菌絲塊接種于已經(jīng)標(biāo)號的無菌液體培養(yǎng)液中,于26℃恒溫培養(yǎng)。分別考察碳源、氮源、水果皮、中藥材對黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖含量的影響。

1.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件。在單因素試驗的基礎(chǔ)上,以黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖含量為考察指標(biāo),采用響應(yīng)面試驗設(shè)計優(yōu)化黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖條件碳源、氮源、水果皮、中藥材,從而獲得黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖的最佳條件。采用分析軟件Design-Expert,設(shè)計4因素3水平的響應(yīng)面分析。獲得回歸方程,根據(jù)多元二次回歸方程,以胞外多糖為響應(yīng)值,對各因素水平進(jìn)行優(yōu)化,得到黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖的最佳發(fā)酵條件。試驗因素水平見表1。

表1 黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖條件響應(yīng)面法試驗因素水平設(shè)計

1.2.4 胞外多糖含量測定。將培養(yǎng)7 d后的黑木耳菌液體發(fā)酵培養(yǎng)液離心,取澄清培養(yǎng)液5 ml,加入15 ml無水乙醇,放置在4℃冰箱12 h,待沉淀析出后進(jìn)行離心,得沉淀粗多糖。通過苯酚-硫酸法測得多糖的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系的考察 試驗得出,無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為 y=38.314x+0.000 4,R2為 0.997 5。由此可見,無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好。

2.2 回歸方程的建立 以碳源、氮源、水果皮、中藥材為自變量,以黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖含量為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面試驗,試驗結(jié)果見表2。將所得試驗數(shù)據(jù)使用Design-Ex-pert軟件分析,得到黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖的二元多次回歸方程為:Y=0.013+0.003 623A+0.000 739 2B+0.000 285C+0.000 688 3D -0.000 332 5AB -0.000 827 5AC+0.000 382 5AD +0.000 075BC - 0.000 765BD-0.000 102 5CD+0.002 13A2+0.001 518B2+0.001 167C2+0.001 597D2。

2.3 回歸分析 通過回歸模型方差分析可以看出,模型的P值為<0.000 1,說明該模型回歸顯著,試驗數(shù)據(jù)得到的F值說明模型的擬合性較好,模型的校正決定系數(shù)R2=0.951 9,可以用于黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖的試驗設(shè)計。

根據(jù)回歸方程,獲得碳源、氮源、水果皮與中藥材響應(yīng)面曲面圖。由圖1可見,其中A(碳源)對黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖含量的影響最為明顯,表現(xiàn)為響應(yīng)面曲線較陡,B(氮源)、C(水果皮)和D(中藥材)對黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖含量的影響相對較弱,表現(xiàn)為曲線較平緩。AB(碳源與氮源的交互作用)與AC(碳源與水果皮的交互作用)對黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖含量的影響較大,BD(氮源與中藥材的交互作用)與CD(水果皮與中藥材的交互作用)對黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖含量的影響一般,AD(碳源與中藥材的交互作用)、BC(氮源與水果皮的交互作用)對黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖含量的影響較小。

通過黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖含量的回歸方程,得出黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖的最佳條件為:碳源可溶性淀粉3%、氮源胰蛋白胨0.15%、水果皮莎白瓜皮4%、中藥材紅景天10%。在此條件下胞外多糖的最大預(yù)測值為0.025 575 7 g/ml。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

2.4 驗證試驗 采用響應(yīng)面獲得的最優(yōu)發(fā)酵條件進(jìn)行黑木耳菌液體發(fā)酵試驗,該條件下實際測得的多糖含量為0.024 51 g/ml,與預(yù)測值相差<5%。可見,回歸方程的預(yù)測值與試驗值之間具有較好的擬合度。故采用響應(yīng)面法優(yōu)化黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖條件準(zhǔn)確可靠,具有實際應(yīng)用價值。

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面法,可以優(yōu)化黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖條件,也可預(yù)測響應(yīng)值,從而獲得最優(yōu)值。該試驗采用響應(yīng)面優(yōu)化方法,確定黑木耳菌發(fā)酵胞外多糖的最佳發(fā)酵條件為碳源可溶性淀粉3%、氮源胰蛋白胨0.15%、水果皮莎白瓜皮4%、中藥材紅景天10%,在此條件下的黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖含量為0.024 51 g/ml。

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