產石杉堿甲新資源研究方法探索

韓文霞，宋 濤，李偉澤，張 寒，邵明明，武永紅

(1.西安醫學院醫學技術系，陜西 西安 710021；2.空軍工程大學校務部門診部，陜西 西安 710051)

產石杉堿甲新資源研究方法探索

韓文霞1，宋 濤2，李偉澤1，張 寒1，邵明明1，武永紅1

(1.西安醫學院醫學技術系，陜西 西安 710021；2.空軍工程大學校務部門診部，陜西 西安 710051)

從老年癡呆癥藥物需求研究到藥物生產開發全方位視角對近期治療老年癡呆癥一線藥物-石杉堿甲來源及生產的發展與動態進行綜述，并對今后產石杉堿甲菌株研發方法進行了展望。源于天然植物的藥物開發歷史悠久且富有生命力，植物提取獲得石杉堿甲為最簡便方式，但植物提取獲得石杉堿甲已面臨植物資源匱乏瓶頸；化學合成生產石杉堿甲仍是研發重要途徑之一，但合成步驟繁瑣、代價昂貴，很難獲得純光學活性的合成物；利用從野生蛇足石杉內分離獲得的內生真菌及其發酵液中提取石杉堿甲正在取得成效；依托生物技術改造菌株獲得石杉堿甲將會是工業化生產開發的一個重要方向。

老年癡呆癥；石杉堿甲；蛇足石杉；內生真菌；菌株改造

伴隨世界人口結構老齡化進一步加劇，阿爾茨海默病防治已變為全球關注焦點。阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)又名老年癡呆癥。目前發展中國家AD患者人數占全球AD患者總人數的56%，預計到2050年將增至71%左右。在AD藥物市場上目前乙酰膽堿酯酶抑制劑類藥物處于主導地位，主要治療藥物有加蘭他敏、多奈哌齊、卡巴拉汀、他克林、美金剛、石杉堿甲。石杉堿甲為從草藥蛇足石杉中提取獲得的有效成分，是治療AD的一線藥物，但目前國內外面臨重大技術難題是植物提取面臨生產周期長，資源匱乏、提取含量及其低微而難以滿足臨床需求的困難；化學合成面臨成本高、副產物多、純化困難、污染環境等而難以大規模應用困難。因此，尋求更有效的生物合成獲得途徑生產石杉堿甲將成為今后藥物研究的熱點。本文對老年癡呆癥發展趨勢、發病機理、治療藥物、藥物來源與生產途徑做了全面綜述，以期為進一步生物合成生產石杉堿甲提供參考。

1 老年癡呆癥

1.1 老年癡呆癥發展趨勢 據中國阿爾茨海默病協會2011年發布的最新調查結果顯示，全球約有3650萬人患有AD，每7 s中就會有一個人患上該疾病，患者的平均生存期一般只有5.9年，已逐步成為威脅老年人健康的主要疾病之一。1998年我國60歲以上人口達到1.2億，并已呈現出老齡化進一步加快趨勢，每年以3.2%左右速度遞增，本世紀中葉可達4億左右，我國將成為世界上老齡人口最多的國家，由此導致老年癡呆癥(Alzheimer's disease，AD)患者急劇增多，由此表明AD藥物市場將是一個容量巨大、前景廣闊的藥物市場。

1.2 老年癡呆癥發病機理 AD是一種以進行性癡呆為主要特征的神經元退變性疾病，主要表現為進行性認知功能衰退、記憶力衰退、性格及行為改變等。乙酰膽堿(Acetyl choline，Ach)是中樞膽堿能神經系統重要的神經遞質，它由膽堿乙酰基轉移酶(Choline acetylase，ChAT)合成、乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase，AchE)分解，通過Ach受體直接參與植物神經功能調節、肌肉運動、大腦思維與記憶功能等；ChAT和AchE活性發生變化，隨后導致Ach代謝失調，最終使中樞膽堿能神經系統的生化特征改變，此為誘發AD發病的重要原因之一。

1.3 治療老年癡呆癥臨床一線藥物 目前乙酰膽堿酯酶抑制劑類藥物在AD藥物市場上處于主導地位。石杉堿甲(Huperzine A，HA)為從民間草藥蛇足石杉中分離獲得的新型石松類單體生物堿，具有多靶點作用，不僅能夠阻斷AchE對Ach的降解而增加腦內Ach的濃度以提高學習和記憶功能；還可以由多因素誘導的氧化應激和細胞凋亡等神經元毒性作用得到抑制[1-2]，使實驗性記憶損害得到顯著性改善。HA是一種強效的可逆性的膽堿酯酶抑制劑，對AchE的抑制作用為毒扁豆堿的3倍、加蘭他敏的30倍[3]，而且外周不良反應低。因此，HA將成為AD藥物市場上的新秀，具有廣泛的臨床應用價值。

2 石杉堿甲

2.1 石杉堿甲的天然來源 近年來，石杉堿甲主要來源為從天然蛇足石杉的植株中提純獲得。目前由天然植株可以獲得HA的植物主要有：蛇足石杉、馬尾杉、藤石松、小接筋草。野生條件下，從孢子落地萌發到地下配子體的生成乃至形成成熟的孢子體，這個過程至少需要15年時間而且產孢量極其低，又難以收集。而由成熟的孢子長成一株高12 cm左右的幼苗，至少需要6年以上的時間。因此依靠天然提取獲得石杉堿甲的資源相當有限，且石杉堿甲在蛇足石杉全草中含量甚微，石杉堿甲的獲得難以滿足臨床需求。也有學者嘗試通過植物組織培養及植株培育方面進行研究[4-7]。但所獲得植株生長速度依然較緩慢，大面積的農業推廣和藥物利用依然較難以推進。因此，僅靠天然提取法獲得HA還遠遠滿足不了市場和臨床用藥的需求。

2.2 石杉堿甲化學來源 近些年國外在分離產HA菌株方面研究較少[8-12]，國外主要集中在利用化學方法合成HA。由于石杉堿甲的特殊療效及臨床藥物的大量需求，國內外研究學者對HA衍生物、其類似物的合成及全合成做了眾多的研究，但其合成步驟繁瑣、代價較高，且存在環境污染及難以獲得純光學活性合成物，至今仍無法進行工業化生產[13-17]。因此利用生物手段尋找石杉堿甲來源成為關注的熱點。

2.3 石杉堿甲微生物來源 HA作為一種非常有潛力的治療AD一線臨床藥物，科研學者正致力于對其進行深入研究。鑒于植物提取和化學合成法生產HA都面臨困難，難以滿足臨床需求，因此研究石杉堿甲的新的獲得途徑更加迫切。基于內生真菌與其共生的宿主可以交換遺傳物質這一理論，從野生蛇足石杉中可以分離純化內生真菌獲得產石杉堿甲菌株。在內生真菌分離方面，目前國內主要是從我國蛇足石杉(千層塔)中分離出芽胞菌屬(Blastomyces Cost. ex Roll)、支頂孢屬(Acremonium)、葡萄孢屬(Botrytis Pets.ex Fr)、黃曲霉(Aspergillus flavus)、鐮刀菌(Fusarium sp.)、炭角菌(Xycarialern species)、枝孢芽枝屬(Cladosporium cladosporioides)、纖姿擬青霉(Paecilonmyces tennis)、炭角菌目(Xylariales)、膠胞炭疽菌(C.gheosporioideES026)、產黃青霉屬(Penicillium chrysogenum)、柄孢殼菌屬(Podospora)內生真菌菌株[18-24]。已分離獲得的內生真菌代謝產物中能夠提取出與宿主植物相同的活性成分HA，但野生菌發酵次生代謝產物中所含石杉堿甲量甚微，離工業化生產石杉堿甲還有很大距離。

3 微生物來源石杉堿甲菌株改造研究方向

隨著植物資源開發利用及面臨資源匱乏難題，如能采用生物合成途徑利用高產HA內生真菌發酵生產石杉堿甲，不僅能有效地解決臨床一線用藥需求，拓寬石杉堿甲的藥物來源、降低成品藥品的價格，而且可有效地保護生態環境。因此如何采用生物學方法制備HA成為當今最受人關注的研究課題。

3.1 原生質體融合技術 隨著食用菌育種需求的發展，原生質體技術應用越來越廣泛。迄今，國內外學者利用原生質體技術對食用菌育種進行了大量的研究[25-28]，已成功從50多種食用菌中制備獲得原生質體，并對獲得的菌種進行了大量研究。目前在真菌育種基礎研究如微生物遺傳育種、酶的定位、細胞壁的合成和基因定位工作中應用廣泛。當今國內外應用原生質體進行誘變育種的技術也趨于成熟化，常用的技術包括：原生質體的制備與再生、原生質體融合、原生質體誘變、轉化及固定化等技術[29-30]。該技術在研究微生物細胞遺傳特性的改造中起著重要作用，與菌體細胞相比，原生質體的成功制備使細胞缺乏細胞壁的保護，因此在各種誘變因素作用下更易發生基因變異。而在其誘變篩選技術中，誘變選育效率與原生質體的制備與再生條件的成功獲得息息相關。且原生質體的獲得也為下一步原生質體的融合奠定基礎。原生質體作為一種簡單高效的菌種改造實驗材料，已經在微生物學育種中得到廣泛應用。近年來，隨著工業和醫藥迅速發展，為獲得更好的經濟效益，真菌原生質體的研究對象逐漸轉向具有工業和臨床價值的生產菌株[31-35]。

3.2 微生物轉化法 微生物轉化方法就是利用微生物細胞代謝過程中產生的一種或多種酶類對復雜底物進行結構改造或修飾。目前微生物轉化方法主要包括：固定化細胞轉化法，固定化酶轉化法，連續轉化法，分批轉化法，孢子轉化法，靜息細胞轉化法和干細胞轉化法。微生物轉化是利用單一微生物的單酶或多酶進行的高密度轉化，本質為酶催化轉化，而直接發酵法是利用多種微生物的酶進行的低密度轉化。因此，微生物轉化具有產物濃度高、副產物少、轉化率高、工藝及后處理簡單的優點。微生物轉化與化學合成方法相比同樣具有很多優勢，如可有效減少副反應及合成步驟、操作條件簡單溫和、提高產率同時大大縮減生產周期等。高度的選擇性為微生物轉化的最大優勢，利用微生物轉化方法可對于某些難以進行或反應復雜的有機化學反應專一、高效地完成[36]。近些年，利用微生物轉化法進行研究逐漸成為研究熱點[37-44]。探索研究采用微生物轉化法，通過利用微生物酶系的修飾作用將底物轉化成HA，將會為HA合成開辟一條新的獲得途徑。

3.3 遺傳轉化研究 自20世紀90年代以來，真菌遺傳轉化已經取得顯著進展。近年來，隨著真菌在分子生物學水平上的研究及進展，真菌的全基因組序列測序越來越多，約有上百種真菌成功實現了遺傳轉化。依托大規模隨機和定點突變技術的應用，改變真菌的遺傳物質，真菌生物學的研究進入了功能基因組學時代。遺傳轉化的研究為深入探明真菌的一些代謝及生理機制提供了有效方法。當前實現真菌的遺傳轉化主要方法：通過原生質體融合進行遺傳轉化(不借助載體)、聚乙二醇介導轉化法(Polyethlene glycol，PEG)、電擊轉化法(Eiectroporation)、電注射法(Electric injection)、基因槍法(Gene gun bombardment)、限制性內切酶介導轉化法(Restriction Ellzyme Mediated DNA Integrafi,REMI)、農桿菌介導轉化法(Agrobacterium tumefaciens—mediatedtransformation，ATMT)，其中農桿菌介導遺傳轉化是目前應用最為廣泛的方法。1995年Bundock等[45]首次對釀酒酵母應用農桿菌質粒實現了遺傳轉化。1998年De Groot等[46]構建了農桿菌介導的絲狀真菌轉化體系，并證明菌組織、原生質體、孢子、菌絲都可作為農桿菌介導轉化的初始材料。自此之后利用農桿菌轉化方法轉化的真菌已達100多種[47]，并有多種真菌利用該方法構建了含豐富類型轉化子的突變體庫。

4 本實驗產石杉堿甲菌株改造研究方向

本實驗室在前期研究中從健康蛇足石杉植株中分離獲得7株產生物堿內生真菌，其中1株菌在搖瓶條件下產生石杉堿甲，為提高產HA菌株的活性，我們采用誘變育種的方法對菌株進行實驗室馴化。目前，在產石杉堿甲菌種選育方面，國內外多以菌體細胞為作用對象，采用各種物理誘變和化學誘變手段進行改造，而以原生質體作為誘變對象以期獲得HA高產菌株尚未見相關研究和報道。本項目通過研究不同因素對HA產生菌原生質體制備與再生的影響，以期獲得原生質體制備和再生的最佳條件，為下一步誘變育種獲得HA高產菌株提供條件，也為原生質體的融合和進一步菌株基因的開發利用打下了基礎。

鑒于目前國內外生物合成途徑中面臨的巨大技術難點是從野生蛇足石杉中分離獲得野生菌株產HA含量較低，且野生菌株在長期脫離宿主植株后將會丟失產石杉堿甲能力，因此本實驗室研究解決的關鍵科學問題之一就是克隆石杉堿甲生物合成基因，構建產HA菌株轉化體系和克隆載體生物表達體系，讓高產有效基因可以長期穩定存在于菌株中。此外，通過對產HA菌株高產有效基因進行測序，在分子水平上闡明高產有效基因表達的新的酶蛋白參與HA生物合成機理又是本實驗室解決的另一個關鍵問題。通過能基于以上研究提出新的生物合成HA研究方法，解決臨床用藥問題；提出新的研究策略，指導瀕危植物有效成分生物合成在分子水平上的研究；提出新的科學假設，揭示全新合成機制。

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Progress on the research methods for developing new resources of huperzine A.

HAN Wen-xia1,SONG Tao2,LI Wei-ze1,ZHANG Han1,SHAO Ming-ming1,WU Yong-hong1.
1.Department of Medical Technology,Xi'an Medical University,Xi'an 710021,Shaanxi,CHINA;2.Clinic,Department of Administrative Affairs,Air Force Engineering University,Xi'an 710051,Shaanxi,CHINA

Huperzine A recently serves as the first-line drug for treating Alzheimer's disease.This paper reviews the latest progress in source and development of Huperzine A from the comprehensive angles of drug needs and pharmaceutical industry.The development of transformation methods in future is prospected.Extraction from natural herbs,as the most convenient way for obtaining huperzine A,has a long history and still has great vitality.However, the method has been faced with a bottleneck of limited plant resources.Chemical synthesis is still one of the important ways for development of huperzine A,but it has the disadvantages of trivial steps,high cost and difficulty in obtaining composites with pure optical activity.Now,adopting biological techniques to obtain huperzine A from endophytic fungi and fermentation of H.serrata has been making great progress.It is recognized that utilizing biological techniques for transformation would become one of the important directions in industrial production of huperzineA.

Alzheimer's disease;HuperzineA;H.serrata;Endophytic fungi;Transformation

R969.4

A

1003—6350（2015）15—2275—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.15.0819

2015-03-01)

國家自然科學基金(編號：81303231)；陜西省教育廳科學研究項目(編號：14JK1632)；陜西省大學生創新創業訓練計劃項目(編號：1753、1636）

韓文霞。E-mail：wenxiahanwendy@163.com