蘋果皮提取物及有效成分C3G對小鼠乳腺惡性腫瘤生長的影響

郭 強，汪心怡，朱其蘋，范楚苓，朱 佩，任海風，李菲菲，汪思應

◇基礎醫學研究◇

蘋果皮提取物及有效成分C3G對小鼠乳腺惡性腫瘤生長的影響

郭 強1，汪心怡2，朱其蘋1，范楚苓1，朱 佩1，任海風1，李菲菲1，汪思應1

目的探討蘋果皮提取物及其有效成分矢車菊-3-葡萄糖苷（C3G）對乳腺惡性腫瘤生長的影響。方法建立E0771小鼠乳腺癌移植瘤模型，觀察飲用蘋果皮汁對小鼠乳腺惡性腫瘤生長的影響。免疫組化法分析飲用蘋果皮汁與飲用普通無菌水組小鼠惡性腫瘤組織中CD31表達差異。HPLC法分析蘋果皮提取物中的化學成分。3D Matrigel膠血管形成實驗探討蘋果皮成分C3G對小鼠乳腺惡性腫瘤血管形成的影響。MTT法和Transwell實驗觀察C3G對血管內皮細胞SVEC增殖和遷移能力的影響。結果飲用含有1%和2%濃度的蘋果皮汁無菌水對乳腺惡性腫瘤生長起到抑制作用。免疫組化法染色顯示飲用蘋果皮汁腫瘤中CD31表達低于未飲用蘋果皮汁組。HPLC法分析顯示C3G是蘋果皮提取物的有效成分之一。3D Matrige膠實驗顯示C3G抑制小鼠乳腺癌細胞E0771血管生成。C3G血管形成抑制小鼠內皮細胞SVEC的遷移能力。結論蘋果皮提取物及其有效成分C3G抑制小鼠乳腺癌生長，該作用可能通過抑制血管生成而實現。

乳腺癌；蘋果皮；矢車菊-3-葡萄糖苷

蘋果含有豐富的植物纖維、維生素、蛋白質和多酚類物質。流行病學調查［1］顯示，多食用蘋果可以降低一些慢性疾病的發生率，其中包括惡性腫瘤。對蘋果皮成分進行分析顯示，其含有多種強抗氧化的化學物質［2］，其抗氧化物質含量約占整個果實的1／2［3］。體外實驗［4-5］表明，蘋果皮可以抑制人前列腺癌細胞、乳腺癌細胞、肝癌細胞、結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲。矢車菊-3-葡萄糖苷（cyanidin-3-glucoside，C3G）是廣泛存在于瓜果蔬菜中的花青素類，但在不同的水果中其含量也是千差萬別［6］，HPLC分析得出C3G是蘋果皮中的重要成分，具有明顯的抗氧化作用，當機體由于氧化應激引起多種疾病時，C3G可以在其中起到保護作用［7］，前期研究［8］證實酒精刺激乳腺癌引起氧化應激，C3G可以抑制這一反應從而保護機體。另外，C3G還被報道［9］可以抑制胰腺癌、肺癌細胞的生長，促進人胃腺癌細胞的凋亡。C3G還可以抑制小鼠血管平滑肌細胞的增殖［10］。在乳腺癌中，C3G也可以抑制腫瘤生長，但其機制尚不清楚。推測C3G可能與乳腺腫瘤血管生成存在一定關系。腫瘤的血管生成與血管轉移密切相關［11］。CD31又稱血小板-內皮細胞黏附因子，是內皮細胞的主要標志物，用于識別良惡性血管源性腫瘤及腫瘤間質中血管生成狀況。腫瘤血管中血管內皮細胞是血管生成的關鍵步驟，該研究主要觀察蘋果皮汁與乳腺惡性腫瘤之間的關系及其提取物C3G在乳腺癌中發揮作用的機制，為乳腺癌治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料市售成熟紅富士蘋果30 kg。小鼠髓樣乳腺癌細胞E0771（簡稱為E0771）由C57BL／6小鼠自發乳腺癌取腫瘤組織原代培養所得。小鼠血管內皮細胞SVEC細胞購自ATCC。雌性C57BL／6小鼠21只，5周齡，SPF級，平均體重18 g，隨機分成3組，分別購置飼養于安徽醫科大學實驗動物中心。

1.2 試劑與儀器C3G由導師汪思應教授從合作實驗室美國肯塔基大學醫學部引進；CD31抗體、DMSO（美國Sigma公司，貨號131M-9）；Matrige膠（美國BD公司）；MTT試劑盒（南京凱基生物技術有限公司）；倒置顯微鏡TMT2-21（美國奧林巴斯公司）、120C（日本尼康公司）；高速營養機（Philips HR1861，日本菲利普公司）；HPLC儀（Hypersil BDS，美國Thermo公司）；CO2細胞培養箱（371型，美國Thermo公司）。

1.3 細胞培養

1.3.1 E0771細胞和SVEC細胞培養 E0771細胞和SVEC細胞均為DMEM培養基與胎牛血清FBS按照9∶1配成DMEM完全培養基，加入青霉素-鏈霉素合劑，抗生素終濃度為：青霉素1×105U／L，鏈霉素0.1 g／L，在37℃、5%CO2培養箱中培養，待細胞80%融合時，傳代培養行后續實驗。

1.3.2 C3G處理組E0771細胞的建立 取對數生長期的細胞E0771接種于60 mm細胞皿中，細胞貼壁后分別用10、20 nmol／L的C3G處理細胞26 h，對照組加入C3G同一溶劑，全程需避光培養。

1.4 含1%、2%蘋果皮汁無菌水制取普通紅富士蘋果削皮后，棄果肉，取果皮，使用高速營養榨汁機榨汁，收集蘋果皮汁，用紗布過濾后，再使用0.2 μm濾器過濾成無菌無渣蘋果皮汁。1%、2%蘋果皮汁濃度分別為100 ml無菌水中加1 g、2 g無菌無渣蘋果皮汁。

1.5 小鼠乳腺癌模型建立取指數生長期的E0771細胞，常規消化計數，用PBS重懸所需細胞，將細胞接種于C57BL／6小鼠第二對右側乳腺處，接種量為每只3.5×105個細胞（100 μl），整個操作過程中E0771細胞置于冰上保存。

1.6 HPLC法分析蘋果皮汁成分收集蘋果皮汁1 kg／L為樣品，樣品溶解于含有甲酸的乙腈水中。標準品為50 mmol／L C3G，同樣溶解于含有甲酸的乙腈水中。檢測條件如下：色譜柱：Thermo Hypersil BDS C18（100 mm×3 mm i.d，3 μm）；流動相：乙腈-0.2%磷酸溶液（14∶86）；流速：0.5 ml／min；檢測波長：250 nm；時間：20.5 min。

1.7 3D Matrigel膠血管形成實驗將Matrigel基質膠置于4℃冰箱過夜融化，將實驗中所需EP管和移液槍頭，24孔板均提前置于4℃預冷，取生長對數期的E0771細胞和C3G處理后E0771細胞，PBS清洗，胰酶消化，計數，保證10 μl DMEM培養基中含有3 000個細胞。取10 μl培養基與200 μl Matrigel膠混合，將混合液接種于24孔板中，置于37℃孵箱20 min，Matrigel膠凝固后，上層加500 μl DMEM培養基防止干燥。約10 d后顯微鏡下觀察細胞形態，計數統計。

1.8 免疫組化實驗解剖小鼠，取腫瘤固定后，脫水，制成蠟塊，標本蠟塊連續切片，確保切片厚度≤2 μm，常規二甲苯脫蠟，使用H2O2去離子水消除內源性過氧化物酶活性，PBS沖洗2次，一抗4℃孵育過夜，孵育結束后使用PBS清洗3次，室溫使用一抗對應二抗孵育15～20 min，PBS清洗3次，每次5 min，辣根酶標記鏈霉素卵白素工作液滴加至標本，室溫孵育15 min，PBS清洗3次，每次5 min，DAB顯色，使用蘇木精染色，然后鹽酸乙醇分化，乙醇溶液按梯度脫水，二甲苯透明后封片，至顯微鏡下拍照觀察。

1.9 MTT實驗取對數生長期細胞E0771、SVEC，消化，計數，分3組（對照組和10、20 nmol／L C3G處理組），每組設立6個復孔，每孔接種相同數目細胞，接種于96孔板。待細胞貼壁后，取0 h 96孔板，避光加入MTT，37℃孵育，隨后取出96孔板，棄上清液，每孔加入DMSO溶解結晶，混勻，490 nm酶標儀檢測光密度值（optical density，OD）值。同上收取24 h及48 h的細胞培養板。

1.10 Transwell遷移實驗將Transwell小室置于24孔板中，在其小室的上下均加入適量的純DMEM培養基水化小室，水化后，在小室下層加入含6%血清的DMEM完全培養基。處理細胞，取對數生長期細胞SVEC，消化、離心，取含血清2%的DMEM完全培養基重懸細胞，計數加入小室上層。置37℃細胞培養箱中培養，約6 h后細胞可由上層小室穿過。隨后收板棄小室上下層培養基，棉簽擦拭上層小室細胞，并用PBS清洗2次，將小室置于固定液中固定已遷移過的細胞，隨后0.1%結晶紫染色。染色結束后，清洗多余染色液，室溫干燥，顯微鏡拍照。每孔隨機取5個視野，計數細胞數目，取平均值。

1.11 動物實驗建立E0771小鼠乳腺癌移植瘤模型后，平均分為3組，飲用水分別為普通無菌水、濃度為1%的蘋果皮汁無菌水、濃度為2%的蘋果皮汁無菌水，隔天記錄腫瘤體積，計算公式為：腫瘤體積（mm3）＝1／2×a×b2（a為腫瘤最長徑mm，b為腫瘤最短徑mm），繪制腫瘤生長曲線，3周后3組小鼠經頸椎脫臼處死，解剖取腫瘤組織、肺組織。

1.12 統計學處理采用SPSS 13.0軟件進行分析，所得數據用表示。各實驗均重復3次，進行t檢驗。

2 結果

2.1 飲用蘋果皮汁對小鼠乳腺腫瘤生長的影響按動物實驗方法，將實驗分為3組，繪制腫瘤生長曲線顯示，飲用1%蘋果皮汁小鼠腫瘤體積低于飲用普通無菌水組，飲用2%蘋果皮汁小鼠腫瘤體積也明顯低于飲用普通無菌水組（P＜0.05）。說明飲用蘋果皮汁可以抑制小鼠乳腺惡性腫瘤的生長。見圖1。

2.2 免疫組化CD31染色結果通過免疫組化法染色，400倍鏡下觀察顯示，飲用含有1%蘋果皮汁無菌水小鼠腫瘤中其CD31表達明顯低于飲用普通無菌水組小鼠。說明蘋果皮汁有可能通過抑制腫瘤血管形成來發揮作用。見圖2。

2.3 HPLC分析結果HPLC分析顯示C3G是蘋果皮提取物的有效成分。見圖3。

2.4 3D Matrige膠血管形成實驗結果使用不同濃度C3G（0、10、20 nmol／L）處理小鼠乳腺癌細胞，MTT實驗顯示經10、20 nmol／L C3G處理后，隨時間增加，與對照組比較差異無統計學意義，說明C3G對E0771細胞增殖無明顯影響，見圖4。當使用C3G后，E0771細胞其血管生成個數明顯低于對照組，說明C3G可能通過抑制血管生成影響乳腺腫瘤的生長，見圖5。

2.5 Transwell實驗結果為了更進一步驗證C3G與血管生長之間的關系，用C3G處理小鼠血管內皮細胞與對照組進行MTT實驗，經C3G處理后的細胞增殖能力與對照組并無明顯差別。見圖6。隨后進行體外Transwell試驗，在小室中同樣接種1×105個細胞，6 h后顯微鏡下觀察，使用C3G處理后的小鼠內皮細胞其穿過細胞數明顯低于對照組，遷移能力下降，說明C3G可以抑制其遷移能力。見圖7。

3 討論

蘋果是生活經常食用水果之一，眾所周知對健康有益，蘋果多酚中的黃酮醇被認為在抑制癌癥中發揮著關鍵作用［5］。研究［6，12］表明，蘋果皮多酚含量是果肉的3～4倍，比例約占整個果實的一半。體外實驗［3-4］顯示，蘋果皮可以抑制人前列腺癌細胞、乳腺癌細胞、肝癌細胞、結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲。本研究結果顯示，當患有乳腺癌的小鼠日常無菌水更換為含有1%和2%濃度的蘋果皮汁無菌水后，隨著時間的增加，其腫瘤體積以及生長速度均低于飲用普通無菌水組。說明日常飲用蘋果皮汁可以減緩乳腺癌的發展。

研究［3-4］顯示蘋果皮抑制腫瘤生長機制主要是蘋果皮成分可以抑制腫瘤的增殖并且促進凋亡。氧化應激與腫瘤有著密切的關系，研究［13］表明腫瘤患者體內氧化應激失調，處于低抗氧化狀態，氧化應激水平增高，蘋果皮中含有大量的黃酮醇，黃酮醇具有強大的抗氧化功能，但因為血管生成是腫瘤發生發展的重要步驟之一，所以該研究探討飲用蘋果皮汁對其腫瘤血管形成是否有一定影響，免疫組化結果顯示，飲用蘋果皮汁其CD31表達明顯低于對照組。

與此同時，HPLC法分析蘋果皮成分，結果顯示C3G是蘋果皮有效成分之一。C3G可以抑制胃癌、肺癌、胰腺癌［14］等腫瘤細胞的增殖。另有研究［15］表明，C3G與糖尿病小鼠中血管形成也有密切關系。本課題組前期實驗［10］顯示，C3G同樣具有潛在強大抗氧化功能，并且可以抑制酒精誘導乳腺癌導致的遷移和侵襲［16］。3D Matrige膠血管形成實驗探討C3G對乳腺癌細胞是否有一定作用，高濃度的3D Matrigel膠適用于體內血管生成和腫瘤細胞遷移及腫瘤模型的建立。3D Matrigel膠血管形成實驗是模擬腫瘤細胞在三維基質內生長，以觀察腫瘤細胞血管形成能力。本研究顯示，經過C3G處理的腫瘤細胞血管形成能力明顯低于對照組，說明C3G不但具有抗氧化作用，還可以抑制腫瘤血管的形成。

通過體內外實驗表明低濃度的蘋果皮汁對乳腺癌生長起到抑制作用，其機制可能是通過抑制血管生成來實現。提取蘋果皮中的C3G，抑制腫瘤細胞增殖及血管形成，為乳腺癌的治療可能提供新的研究方向。

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Effect of apple peel extract and its active components C3G on mouse’s malignant breast tumour growth

Guo Qiang1，Wang Xinyi2，Zhu Qiping1，et al
（1Dept of Pathophysiology，School of Basic Medical Sciences，2Dept of Clinical Medicine，Anhui Medical University，Hefei 230032）

ObjectiveTo investigate the effect of the apple peel extract and its active ingredients cyanidin-3-glucoside（C3G）on malignant breast tumour growth in vivo.MethodsC57BL／6 mouse breast cancer model was built to observe the effect of drinking apple peel juice on mouse breast tumour growth.IHC was used to analyze the differential expression of CD31 in the apple peel extract treated group and the control group.HPLC was used to analyze the chemical composition of apple peels extract.The effect of apple peel component C3G on blood vessels formation of mouse breast cancer cell line E0771 was investigated through 3D Matrigel.The effect of C3G on proliferation and migration of SVEC were determined via MTT and Transwell.Results1% and 2% concentration of apple peel juice inhibited the tumour growth in mouse breast cancer model.The expression of CD31 in apple peel extract treated group was lower than that of control group indicated by IHC staining.C3G was one of the effective components of the apple peel extract through HPLC analysis.C3G inhibited the blood vessels formation of mouse breast cancer cell line E0771 indicated by 3D Matrigel.The migration of SVEC cells was inhibited by C3G.ConclusionThe apple peel extract and its effective component C3G inhibit the tumour growth of mouse breast cancer，which is possibly achieved by inhibiting its angiogenesis.

breast cancer；apple peel；cyanidin-3-glucoside

R 363.2

A

1000-1492（2015）12-1711-05

時間：2015-11-18 10：12：34

http：／／www.cnki.net／KCMS／detail／34.1065.R.20151118.1012.002.html

2015-09-08接收

國家自然科學基金（編號：81302319）；安徽省自然科學基金（編號：1308085MH121）；安徽省留學回國人員科研項目（編號：2009-2011）

安徽醫科大學1基礎醫學院病理生理學教研室、2臨床醫學院，合肥 230032

郭 強，女，碩士研究生；汪思應，男，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：sywang＠ahmu.edu.cn