病毒性心肌炎小鼠體內(nèi)NT-proBNP的水平變化及意義

徐艷艷，范曉晨

病毒性心肌炎小鼠體內(nèi)NT-proBNP的水平變化及意義

徐艷艷，范曉晨

目的探討氨基末端腦利鈉肽前體（NT-proBNP）在病毒性心肌炎（VMC）小鼠體內(nèi)的水平變化及其意義。方法100只Balb／c小鼠隨機分為VMC組（n＝60）和對照組（n＝40）。VMC組小鼠腹腔注射柯薩奇B3病毒（CVB3），對照組注射等量不含病毒的DMEM液。VMC模型建立后分別在第3、7、14、28天每組隨機處死10只小鼠，留取血液和心臟標本。使用ELISA法檢測兩組小鼠血清中NT-proBNP含量，HE染色觀察心肌組織病理改變。分析VMC組小鼠不同時間血清NT-proBNP含量與心肌組織病理積分的關系。結(jié)果VMC組小鼠血清NT-proBNP水平明顯高于對照組（P＜0.05），且VMC組不同時間的NT-proBNP水平之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。血清NT-proBNP水平與心肌組織病理積分呈顯著正相關性（r＝0.829，P＜0.05）。結(jié)論血清NT-proBNP水平可反映VMC小鼠心肌損傷的嚴重程度，可作為判斷其危險分層的血清學指標之一。

病毒性心肌炎；小鼠；氨基末端腦利鈉肽前體

病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）是由以腸道病毒為主感染引起的心肌組織局灶性或彌漫性炎癥。其臨床表現(xiàn)多變，輕者可無癥狀，重者可猝死，慢性病程可演變?yōu)閿U張型心肌病［1］。目前臨床上尚無特異性診療方法。腦利鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）是利鈉肽家族中的一員。氨基末端腦利鈉肽前體（N-terminal pro-brain natriuretic peptide，NT-proBNP）是由心室肌細胞分泌的proBNP降解而成［2］。目前國內(nèi)外關于NT-proBNP的研究［3-4］多集中在心功能不全、腎功能不全、急性冠脈綜合征和肺部疾病等。但NT-proBNP在VMC中的研究鮮有報道。該研究以VMC模型小鼠為基礎，檢測其體內(nèi)NT-proBNP水平的變化，探討血清中NT-proBNP水平與VMC之間的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗病毒 柯薩奇病毒B3（coxsackievirus B3，CVB3）M株是由安徽醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院微生物教研室惠贈，并在Hep-2細胞中傳代，反復凍融3次使病毒完全釋放，離心取上清液分裝，于-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?6孔板接種Hep-2細胞，待長滿后加入倍比稀釋后的病毒液，每個稀釋度8個復孔。逐日觀察4 d，顯示細胞縮小，浮于維持液。病變達到（+++）判定為病變孔，依據(jù)Reed-Muench方法計算病毒的組織培養(yǎng)半數(shù)感染量（50%tissue culture infectious dose，TCID50）為1×10-7。

1.1.2 實驗動物 清潔級雄性Balb／c小鼠100只，4周齡，于清潔級環(huán)境中飼養(yǎng)，重13～16 g，購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備 Balb／c小鼠隨機分為VMC組（n＝60）和對照組（n＝40）。VMC組腹腔注射0.1 ml含1×102TCID50CVB3的DMEM液，對照組腹腔注射等量的不含CVB3的DMEM液。以后每天觀察記錄小鼠飲食飲水情況、活動變化、毛發(fā)色澤改變、精神狀態(tài)、對外界刺激反應情況、死亡情況等。

1.2.2 標本采集 將接種當天記為第0天，于第3、7、14、28天每組隨機抽取10只，摘眼球取血，4℃靜置30 min，3 000 r／min離心10 min，分裝，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩囝i脫臼處死，碘伏棉球消毒胸腹部3次，打開胸腔取出心臟，沿心臟長軸面切成兩部分，生理鹽水沖洗干凈后放入10%福爾馬林溶液固定。

1.2.3 主要試劑及血清NT-proBNP水平的測定

NT-proBNP酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自蘇州卡爾文生物科技有限公司。取出凍存的血清，室溫下放置30 min使其完全解凍；取出ELISA試劑盒，室溫下平衡20 min，同時觀察濃縮洗滌液有無結(jié)晶，如有則水浴加熱使其溶解。按1∶20蒸餾水稀釋濃縮洗滌液。取出所需酶標板條數(shù)，設置標準品孔、空白孔、樣本孔。標準品孔內(nèi)各加不同濃度的標準品50 μl；空白孔不加；樣本孔分別加入第3、7、14、28天VMC組和對照組小鼠血清10 μl，每孔再加40 μl樣本稀釋液。除空白孔外，每孔加辣根過氧化物酶標記的檢測抗體100 μl，封板膜封住，37℃恒溫箱溫育1 h。棄去反應孔內(nèi)液體，吸水紙上拍干。每孔加滿洗滌液，防止臨近孔洗滌液交叉污染。靜置1 min，棄去洗滌液，吸水紙上拍干，如此反復5次。每孔各加50 μl底物A、B，避光，37℃恒溫箱溫育15 min。每孔加50 μl終止液終止反應。將96孔板放酶標儀內(nèi)，調(diào)至450 nm波長處測定光密度（optical density，OD）值。根據(jù)標準品OD值制出OD值-濃度的標準曲線。計算各組小鼠血清中NT-proBNP的濃度值。

1.2.4 心肌病理學檢查 心肌組織固定后石蠟包埋，3 μm厚切片。常規(guī)HE染色，光鏡下觀察心肌病理改變。染色結(jié)果請兩位病理科醫(yī)師按照Rezkalla et al［5］方法進行雙盲閱片計算心肌病理（炎癥細胞浸潤和壞死）積分，即每張切片隨機選5個高倍鏡視野（×400），計算每個視野內(nèi)炎癥細胞浸潤和壞死面積占整個視野的百分比：無病變計0分，病變＜25%計1分，25%～49%計2分，50%～75%計3分，＞75%計4分。

1.3 統(tǒng)計學處理采用SPSS 16.0軟件進行分析，計量資料以表示。組間比較采用兩獨立樣本均數(shù)t檢驗、完全隨機設計資料或重復測量設計的方差分析，兩變量間相關分析采用線性相關分析。

2 結(jié)果

2.1 一般情況VMC組小鼠第3天開始有少飲、少食、少動、聳毛、脫毛、毛色漸暗、精神萎靡、體重減輕、對外界刺激不敏感等異常情況出現(xiàn)并逐漸加重，第4天開始有死亡，第7～10天為死亡高峰，第13天后無小鼠死亡，并且小鼠精神狀態(tài)逐漸恢復。小鼠共死亡11只，死亡率達18.33%。對照組小鼠飲食正常、活動正常、毛色光滑發(fā)亮、體重增加、對外界刺激反應敏捷，無死亡現(xiàn)象。

2.2 心肌組織病理變化

2.2.1 心臟大體改變 VMC組解剖顯示7～14 d小鼠心臟外膜出現(xiàn)大小不等的白色點狀、斑塊狀壞死灶，并且隨著病變進展斑塊大小相繼發(fā)生改變。心外膜下可見點片狀淤血斑，心肌纖維彈性變差。對照組未見異常變化。

2.2.2 心肌組織形態(tài)學改變 對照組心肌纖維結(jié)構(gòu)正常，橫紋清晰，未見異常。VMC組第3天顯示心肌細胞腫脹，橫紋模糊不清，心肌纖維扭曲，間質(zhì)內(nèi)有少量炎癥細胞浸潤。第7天可見大量炎癥細胞浸潤，心肌細胞大量變性、壞死融合成片，邊緣亦可見核碎裂。第14天部分炎癥病灶逐漸吸收，但仍處于較高水平，血管旁纖維細胞增生。第28天炎癥細胞進一步減少，心肌細胞減少，纖維細胞增多，膠原纖維沉積，血管旁尤其明顯，纖維走形紊亂。見圖1。

2.2.3 各組小鼠心肌組織病理積分比較 采用重復測量設計的方差分析顯示，VMC組各時間小鼠心肌組織病理積分比較，差異有統(tǒng)計學意義（F＝8.67，P＝0.001）。VMC組各時間小鼠心肌組織病理積分與對照組比較差異亦有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 VMC組與對照組小鼠心肌組織病理積分比較（分，）

表1 VMC組與對照組小鼠心肌組織病理積分比較（分，）

時間VMC組對照組t值P值第3天1.20±0.450.00±0.006.00＜0.001第7天2.60±0.550.00±0.0010.61＜0.001第14天2.00±0.710.00±0.006.33＜0.001第28天0.80±0.450.00±0.004.000.004

2.3 VMC組和對照組小鼠血清NT-proBNP水平的比較

2.3.1 各組小鼠血清NT-proBNP濃度比較 VMC

組小鼠血清中NT-proBNP濃度在接種CVB3后第3天開始升高，第7天達到高峰，以后逐漸降低，第28天仍高于正常。采用方差分析各時間NT-proBNP濃度，差異有統(tǒng)計學意義（F＝78.07，P＜0.001）。各時間VMC組NT-proBNP濃度與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 VMC組和對照組小鼠血清NT-proBNP的濃度值（pg／ml，）

表2 VMC組和對照組小鼠血清NT-proBNP的濃度值（pg／ml，）

時間VMC組對照組t值P值第3天775.80±108.3087.23±5.688.49＜0.001第7天1 864.93±60.4494.75±26.4039.24＜0.001第14天1 281.24±53.28102.31±48.1128.67＜0.001第28天413.89±97.1090.51±11.344.520.006

2.3.2 VMC組各時間血清NT-proBNP濃度比較

采用方差分析顯示，VMC組各時間血清NT-proBNP濃度比較差異有統(tǒng)計學意義（F＝260.76，P＜0.05）。

2.4 VMC組血清NT-proBNP的濃度與心肌病理積分間的相關性線性相關分析顯示，VMC組小鼠第3、7、14、28天血清NT-proBNP濃度與其心肌組織病理積分間呈顯著正相關性（r＝0.829，P＜0.05）。

3 討論

Balb／c鼠對嗜心肌病毒極其敏感，且繁殖快，易飼養(yǎng)，因而成為國內(nèi)外研究VMC首選的實驗動物。本研究以4周齡、雄性Balb／c小鼠為研究對象，通過腹腔注射0.1 ml CVB3來建立VMC模型。VMC組小鼠于接種CVB3后第3天開始有出現(xiàn)少動、少食、精神萎靡等癥狀，第4天開始有小鼠死亡，第7～10天死亡7只，為死亡高峰，占全部死亡小鼠的63.63%，并且VMC組小鼠心肌組織病理證實有不同程度的炎性細胞浸潤伴鄰近心肌細胞的變性或壞死，表明本實驗中VMC模型構(gòu)建成功，為進一步分析NT-proBNP水平與VMC之間的關系奠定了基礎。

BNP是目前最常被用到的利鈉肽家族的核心成員，具有利尿、利鈉、舒張血管、抑制交感神經(jīng)、拮抗腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)等生物學活性。NT-proBNP無生物活性，但半衰期是BNP的3～6倍，且穩(wěn)定性好。NT-proBNP以此優(yōu)勢而應用于臨床。

Narin et al［6］研究有擴張性心肌病病史的心臟衰竭患者的心臟超聲，并檢測其血清NT-proBNP，發(fā)現(xiàn)NT-proBNP比傳統(tǒng)超聲心動圖的各種參考指數(shù)更敏感有效，并且NT-proBNP是曾有心肌炎病史患兒持續(xù)存在心功能不全的良好標志物［3］。目前，研究［7］已證實丙型肝炎病毒也是VMC的致病原，對于慢性丙型肝炎病毒感染患者，通過檢測NT-proBNP可以判斷患者是否出現(xiàn)心功能不全。本研究通過建立VMC小鼠模型來探討疾病發(fā)展過程與血清NT-proBNP水平之間的關系，結(jié)果顯示不同時期VMC組小鼠血清NT-proBNP水平均明顯高于對照組。VMC小鼠在病毒感染早期（第3天），心肌組織輕度病變，但血清NT-proBNP水平與對照組相比已有明顯升高；隨著疾病的進展，第7天心肌組織病理改變達到最明顯時，NT-proBNP水平也達到最高；其后，炎癥逐漸消散，NT-proBNP也隨之降低，但仍高于正常值。VMC組不同時間的NT-proBNP水平差異有統(tǒng)計學意義。在心肌組織病變早期，宿主尚未形成明顯的免疫應答，病毒大量復制，這不僅可直接損傷被感染心肌細胞，還可通過腸道病毒蛋白酶2A的超表達來清除抗肌萎縮蛋白，導致心肌細胞骨架與外部基底膜分離，從而破壞心肌細胞的完整性，進一步導致心肌細胞收縮力降低、細胞死亡［8-9］。研究［10-11］表明，此期心肌細胞的線粒體DNA（mtDNA）缺失率增加，線粒體基因表達降低，心肌細胞能量供應不足。心臟泵血能力降低，心室內(nèi)血液積聚，牽拉房室壁，刺激心肌細胞分泌NT-proBNP。隨著疾病的發(fā)展，病毒以及自身免疫對心肌細胞的損傷、間質(zhì)水腫、大量炎癥細胞的浸潤、一氧化氮及細胞因子的間接損傷使心肌組織壞死并融合，心肌收縮和松弛嚴重損傷，依從性降低，引起心肌收縮和舒張功能明顯障礙，心輸出量降到最低甚至發(fā)生心源性休克［12］。此外，在病變高峰期，參與維持細胞骨架和新陳代謝的蛋白質(zhì)比例也發(fā)生很大變化［13］。同時，mtDNA缺失率在此期達到頂峰，并且mtDNA缺失率與心功能不全的程度相一致［10］。心肌的結(jié)構(gòu)、功能、能量供應全部遭到破壞，血液進一步積聚，房室壁的牽拉達到頂峰，從而引起NT-proBNP的大量分泌。同時這也解釋了小鼠在第7～10天死亡率達到頂峰的原因。恢復期炎癥逐漸吸收，壞死灶溶解消散，用增生的成纖維細胞取代之，心肌間質(zhì)增加。心肌收縮力逐漸恢復，心室依從性明顯改善。mtDNA缺失率以及參與維持細胞骨架和新陳代謝的蛋白質(zhì)比例都逐漸恢復。血管內(nèi)皮細胞生長因子可促進血管生成、細胞分裂增殖分化。在病毒感染后，血管內(nèi)皮細胞生長因子表達就逐漸增加，第14天達到高峰，以促進心臟修復［14］。因此，血清中NT-proBNP水平也隨之降低，但仍高于對照組。而這正好與本研究的另一結(jié)論相一致：VMC組血清NT-proBNP濃度與心肌組織病理積分呈顯著正相關性。以上闡述表明血清NT-proBNP可作為一種方便快捷、反應靈敏的判斷VMC心肌損害嚴重程度的生化指標。

VMC的發(fā)病與機體的遺傳易感性有關。對于易感者，入侵的病毒對心肌細胞的直接損傷、炎癥細胞及各種細胞因子的間接損傷作用、T淋巴細胞的溶細胞作用等對心肌組織的攻擊更為嚴重，并且病毒、炎癥介質(zhì)可激活體內(nèi)多種轉(zhuǎn)錄因子使心肌細胞凋亡［15］。在病變高峰時心臟結(jié)構(gòu)受到嚴重破壞，血液泵出大大降低，射血分數(shù)銳減，引起心臟衰竭。Sun et al［16］提出NT-proBNP是當前診斷心臟衰竭并評估其預后的生化標志物中的金標準。本研究結(jié)果顯示，血清NT-proBNP水平可以反映VMC心肌損傷的嚴重程度，可作為判斷其危險分層的血清指標之一。此外，血清NT-proBNP易于檢測，可以隨時掌握疾病的病情變化，進而有利于制定下一步的治療方案。

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The changes and significance of serum NT-proBNP levels in mice with viral myocarditis

Xu Yanyan，F(xiàn)an Xiaochen
（Dept of Pediatrics，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo investigate the changes and significance of serum N-terminal pro-brain natriuretic peptide（NT-proBNP）levels in mice model with viral myocarditis（VMC）.Methods100 Balb／c mice were randomly divided into VMC group（n＝60）and control group（n＝40）.Mice in VMC group were injected intraperitoneallycoxsackievirus B3（CVB3），while mice in control group were treated with the same amount of virus-free DMEM cultivate liquid.10 mice of each group were sacrificed on 3，7，14，and 28th day after VMC modeling and their blood and heart tissues were collected.The serum NT-proBNP levels in two groups of mice were detected by ELISA.Pathological changes in myocardial tissue were examined with hematoxylin and eosin stain.The relationship between serum NT-proBNP concentration and cardiac pathology score of VMC group at different time points were analyzed.ResultsThe serum NT-proBNP levels of VMC group were significantly higher than that of control group（P＜0.05）.There was a significant statistical difference between NT-proBNP levels of VMC group at different time points（P＜0.05）.The NT-proBNP level was positively correlated with myocardial histopathology scores（r＝0.829，P＜0.05）.ConclusionSerum NT-proBNP levels may reflect severity of myocardial injury in mice with VMC.NT-proBNP can be used as one of serum indicators to judge the risk stratification in mice with VMC.

viral myocarditis；mice；N-terminal pro-brain natriuretic peptide

R 725.4

A

1000-1492（2015）12-1753-05

時間：2015-11-18 10：12：34

http：／／www.cnki.net／KCMS／detail／34.1065.R.20151118.1012.020.html

2015-09-08接收

安徽省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研課題（編號：2009ZY36）

安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院兒科，合肥 230022

徐艷艷，女，碩士研究生；

范曉晨，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導師，責任作者，E-mail：xcfan2000＠163.com