ATP7B基因突變與肝豆狀核變性發病關系的探討

徐 彬，余元勛，鮑遠程，王迎新，劉 萍，李建平，朱 霖

ATP7B基因突變與肝豆狀核變性發病關系的探討

徐 彬1，余元勛1，鮑遠程2，王迎新1，劉 萍1，李建平1，朱 霖1

目的對中國人肝豆狀核變性（WD）患者ATP7B全基因測序，分析其突變及與WD的關系，并探討ATP7B基因復合突變在WD發病中的意義。方法對臨床確診的WD患者84例及20例健康者采集口腔黏膜細胞，提取基因組DNA為模板，應用聚合酶鏈反應對ATP7B全部外顯子5′端→3′端擴增；運用DNA直接測序法檢測突變，并分析ATP7B基因突變臨床意義及與預后的關系。結果在84例患者中，ATP7B基因突變率為82.14%，還發現一些國內較少報道的ATP7B基因復合突變，可能與WD相關。結論ATP7B基因突變有較大的異質性，對該基因突變的檢測，能發現有相關ATP7B基因突變的WD患者。

肝豆狀核變性；外顯子；基因突變；聚合酶鏈反應

肝豆狀核變性（Wilson disease，WD）是一種常染色體單基因隱性遺傳的銅代謝障礙疾病，大多在5～35歲起病，人群發病率為1／30 000，攜帶者概率為1／90［1-2］；一般肝病出現較早，神經系統癥狀常在青春期后出現［3］。WD致病相關的P-型銅轉運酶（ATP7B）基因定位于13ql4.3，含21個外顯子、20個內含子，編碼ATP7B［4］，后者參與銅跨膜轉運［5-6］。ATP7B基因突變能導致ATP7B改變、WD引起銅藍蛋白合成減少、銅離子排出受阻，銅在肝、腦、角膜等組織沉積，導致多臟器損害［7］、肝硬化、神經／精神癥狀、角膜K-F環、尿銅增加等。ATP7B基因突變常分布在各外顯子，迄今已發現至少651種突變，突變形式有錯義／無義突變（占63%）、小片段缺失（占17%）、小片段插入（占8%）、剪接突變（占9%）、大片段缺失（占2%）、同義突變（占2%）［8］等；國內以前較少報道復合突變。作者對84例WD患者ATP7B基因進行全外顯子+5′端→+3′端的測序，旨在探討ATP7B基因的突變的異質性及與WD發病的關系。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取安徽中醫藥大學第一附屬醫院2009年5月～2014年7月收治的84例中國漢族WD患者，診斷標準參照中華醫學會WD診斷指南［9］及美國的AASLD的WD診斷及治療指南［10］；其中男55例，女29例；年齡6～56（20.9±3.6）歲；其中49例為先證者，其余35例來自于13個患者家庭。20例中國漢族健康輸血員，男14例，女6例；年齡21～32（27.7±2.8）歲，作為對照組。所采樣本對象有臨床資料及知情同意書。本研究旨在對臨床上確診為WD或疑似WD的患者家系成員，采用分子生物學技術進行遺傳學確診，能確定ATP7B基因突變型、SNPs。

1.2 方法

1.2.1 生化測定 WD組及對照組的WD相關生化測定16項由安徽中醫藥大學第一附屬醫院按常規完成，并應用軟件對兩組化驗結果進行統計學分析。

1.2.2 基因診斷 本研究參考方法［11］進行基因診斷，簡述如下：對所有明確診斷的WD患者、參與研究的家屬、對照者，取口腔黏膜細胞，制備基因組DNA溶液，凝膠電泳為一條帶，達電泳純；基因組DNA溶液經紫外分光光度計檢測，測量光密度（optical density，OD）值，OD260／OD280為1.8，純度合格；基因組DNA溶液濃度為1 μg／μl。引物設計參考美國國立生物技術信息中心的信息，根據參考文獻［11］并利用Premier 5.0軟件設計外顯子5′端→3′端的21對PCR擴增引物，由上海生工生物公司合成。反應體系和擴增條件及產物測序按文獻［11］進行。測序PCR的反應產物經熒光全自動DNA正向測序及反向測序，分析ATP7B基因各外顯子5′端→3′端的突變，對后者中有疑問者，均經PCR克隆測序后再確認。測序儀：ABI3730型；分析軟件：SeqMan、BioEdit。WD患者和健康者ATP7B基因測序結果與GenBank中正常者ATP7B基因相應序列比對，分析突變情況。

1.3 統計學處理生化檢測所得數據以Excel建庫，采用SPSS 19.0軟件進行分析，計量資料以表示。數據做正態性W檢驗和方差齊性Levene檢驗，采用隨機區組設計的方差分析，比較組間差異。ATP7B基因的所有外顯子5′端→3′端，DNA的測序結果，與由GenBank的正常者ATP7B基因相應序列進行比對，分析突變情況。

2 結果

2.1 生化檢測結果84例WD患者及20例健康者的生化檢測結果見表1。84例WD患者血清銅離子、銅氧化酶、銅藍蛋白（ceruloplasmin，CP）的水平明顯低于20例健康者，差異有統計學意義（P＜0.01），其中ATP7B基因突變者的血清銅離子、銅氧化酶、CP水平均明顯降低。

表1 84例WD患者及20例健康者生化檢測結果（）

表1 84例WD患者及20例健康者生化檢測結果（）

項目WD組對照組P值年齡（歲）19.240±3.57721.700±2.680-年限（年）4.560±4.2480-白細胞（×109／L）4.462±1.5726.141±1.425＜0.05紅細胞（×1012／L）3.862±0.5485.583±0.639＜0.05血紅蛋白（g／L）120.737±21.536 129.612±15.132-血小板（×109／L）93.526±37.216179.630±47.720＜0.05 ALT（IU／L）78.371±49.23728.710±8.328＜0.05 AST（IU／L）69.710±47.31033.260±9.851＜0.05總膽汁酸（μmol／L）38.826±31.9586.539±3.253＜0.05總膽紅素（μmol／L）28.275±20.77214.264±5.349＜0.05直接膽紅素（μmol／L）18.352±13.7755.217±1.391＜0.05血清白蛋白比（g／L）39.172±7.72843.629±4.612＜0.05白／球蛋白（mmol／L）1.856±0.4441.827±0.317-尿素氮（mmol／L）4.824±1.3704.731±1.297-肌酐（μmol／L）63.032±18.94178.235±20.221＜0.05血清銅（μmol／L）8.993±5.87117.147±3.352＜0.01銅氧化酶（活性單位／L）0.074±0.0670.421±0.113＜0.01 CP（g／L）0.086±0.0300.321±0.031＜0.01

2.2 WD患者ATP7B的基因突變測序本次研究通過對84例WD患者的ATP7B基因的全部21個外顯子5′端→3′端進行直接DNA測序，顯示WD患者ATP7B基因突變率較高，種類較多，共檢出23例純合子突變（18例Arg778Leu純合子突變和5例Arg919Gly純合子突變，占總突變的27.38%），36例單純雜合子突變（占總突變的42.86%），10例復合突變（占總突變的11.90%），15例未檢出突變（占總突變的17.86%）。84例WD患者168個ATP7B等位基因中的突變總檢出率為82.14%，共檢測出致病突變12種，其中有5種復合突變，突變位點分布于全部外顯子，表現在8、10、12、13、16、21外顯子，其中6種單純突變為：Arg969Glm、Ser975Tyr、Arg778Leu、Gly988Val、Pro992Leu、Ala1018Val，5種復合突變的具體信息見表2。在20例健康對照者中沒有ATP7B基因突變。通過在PubMed上進行文獻檢索，以及在http：／／www.wilsondisease.med.ualberta.Ca／database.asp和http：／／www.hgmd.cf.ac.uk／ac／validate.phP進行查詢，結果顯示5種復合突變國內報道較少，這5種ATP7B基因復合突變的相應的測序圖見圖1～5。

表2 WD患者ATP7B的基因突變

3 討論

WD患者中約42%以肝臟損傷為首發表現，約44%以基底神經節及大腦其他區域銅沉積而呈現神經、精神系統癥狀為首發表現［3］。本研究中ATP7B基因突變患者血清銅離子、銅氧化酶、CP的水平明顯低于正常對照組，差異有統計學意義，表明WD患者ATP7B基因突變失活后，肝排銅減少，使患者出現WD相關血清生化檢驗（+），與WD臨床發病呈正相關性。

ATP7B是銅離子轉運P型ATP酶，含1 411個氨基酸殘基，分子量約150 ku，在細胞外銅離子水平正常時，ATP7B位于細胞核周圍；在細胞外銅離子水平升高并大量進入細胞時，ATP7B轉移到細胞質，結合銅離子后，促進ATP結合區結合ATP，使ATP水解釋放能量，使天冬氨酸激酶磷酸化區（P區）磷酸化，然后ATP7B轉位到細胞膜，經毛細膽管處排出銅離子。

當ATP7B發生突變時，導致其功能部分或全部喪失，使銅離子經膽汁排出減少，同時CP合成減少，使血CP減少，血中白蛋白疏松結合的銅離子增加，易沉積到中樞神經系統、肝臟、腎臟、角膜等處，造成相應臟器的形態結構破壞、功能改變而致病。

本研究表明，Arg969Glm、Ser975Tyr、Arg778Leu、Gly988Val、Pro992Leu、Ala1018Val等單純突變，在WD患者陽性率相對較高（占總突變的42.86%），10例復合突變（占總突變的11.9%）；由于對ATP7B全基因外顯子掃描，本文突變總檢出率較高為82.14%，5種復合突變少見報道，突變位點分布于全部外顯子，與其他研究［12］結果相一致；如再對內含子掃描，突變檢出率可進一步提高［13］。說明ATP7B基因突變可引發單基因遺傳WD，可能是WD發病的主要原因。

WD患者ATP7B基因的復合突變形式多樣，69號患者有外顯子2、7復合突變，第2外顯子突變出現在2銅離子結合區，使ATP7B不能結合銅離子、不能活化，排出銅離子減少；第7外顯子突變出現在CPC陽離子跨膜轉運區，使ATP7B一直停留在核周高爾基體外側網絡，不能到細胞膜排出銅離子。75號患者有外顯子1、2、21及18內含子區突變，第1、2外顯子突變出現在1、2銅離子結合區，使ATP7B不能結合銅離子、不能活化，排出銅離子減少；第21外顯子突變出現在C末端區，阻礙調節ATP7B功能；第18內含子區純合突變，使ATP7B表達水平降低；結果可引起銅轉運停滯，發生疾病。79號患者有外顯子1、2突變，第1、2外顯子突變出現在1、2銅離子結合區，使ATP7B不能結合銅離子、不能活化，排出銅離子減少。83號患者有外顯子8、14內含子區突變，第8外顯子突變出現在CPC陽離子跨膜轉運區，使ATP7B一直停留在內質網，易被泛素蛋白酶體降解，不能到細胞膜排出銅離子；14內含子區存在雜合突變，使ATP7B表達水平降低，可引起銅轉運停滯。84號患者有外顯子3、16突變，第3外顯子突變出現在3銅離子結合區，使ATP7B不能結合銅離子、不能活化，排出銅離子減少；第16外顯子突變，使ATP7B不能形成ATP7B-酰基磷酸鹽，使ATP不能供應能量，使ATP7B不能移位轉運銅離子。

對于臨床檢查和實驗室檢測后仍很難確診的WD患者，通過對ATP7B基因進行分子遺傳學檢測，明確致病的等位基因來確診非常有用。隨著研究的深入，WD的檢出率最高可達100%［12］。文獻報道，ATP7B基因復合突變患者一般比單純突變患者的臨床癥狀常更重，Maier-Dobersberger et al［14］對ATP7B基因突變位點研究后認為，復合突變常比單一突變發病更早。

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Research for the relationship of ATP7B gene mutations and WD

Xu Bin1，Yu Yuanxun1，Bao Yuancheng2，et al
（1Anhui Medical College，Anhui Provice Medical Genetics Center，Hefei 230061；
2Dept of Neurology，The First Affiliated Hospital of Anhui Traditional Chinese Medicine University，Hefei 230031）

ObjectiveTo sequence the WD ATP7B gene，analyze the relationship of the mutations and WD，find in Chinese WD patients the ATP7B gene complicated mutation meaning.Method Geting genomic DNA from clinically diagnosed 84 cases of WD patients and 20 cases of the health people，amplifying all exons 5′end→+3′end of ATP7B gene by PCR.PCR products and mutations were analyzed by DNA direct sequencing and analyzing the clinical meaning and the relationship with the mutations.ResultsWe found in the 84 cases the ATP7B gene mutation rate was 82.14%and found some complicated mutations that were rarely reported in China and had relatioship with WD.ConclusionATP7B gene mutations have the heterogenecity and the mutation checking can find related ATP7B gene mutation carried WD patients.

Wilson disease；exons；gene mutations；PCR

R 742.4

A

1000-1492（2015）12-1762-05

時間：2015-11-18 10：12：34

http：／／www.cnki.net／KCMS／detail／34.1065.R.20151118.1012.024.html

2015-10-09接收

安徽高等學校省級自然科學研究項目（編號：KJ2014A128）

1安徽醫學高等專科學校安徽省遺傳醫學中心“原安徽醫

科大學遺傳室”，合肥 230061

2安徽中醫藥大學第一附屬醫院神經內科，合肥 230031

徐 彬，男，副研究員，責任作者，E-mail：xb.1030＠163.com