慢性HBV 感染者HBV 前C 區/基本核心啟動子區基因突變與臨床應用

湖北省中醫院檢驗科（湖北 武漢，430074）

自1989年Carman［1］首次發現HBV前C 區1896 位點的變異可形成HBeAg（－）的CHB之后，Okamoto等［2］研究發現BCP區變異也可形成HBeAg（－）CHB。國內外對PreC 區/BCP 區變異的分子結構、生物學改變及對疾病的影響等方面進行了一系列研究［3，4］。近年來，HBV PreC 區/BCP 區變異研究也出現新的進展［5］，為了解慢性HBV 感染者HBV PreC 區變異與HBV復制關系，我們對慢性HBV感染者進行研究，探討其HBV PreC區/BCP 區基因突變與其病程進展的相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 我院2010年10月至2013年6月住院患者。其中AsC組63例（男42例，年齡28～68歲；女21例，年齡24～65歲）；CHB 組82例（男68例，年齡32～71歲；女14例，年齡25～68歲）；CHB-LC組20例（男15例，年齡45～76歲；女5例，年齡46～67歲）。所有病例診斷均符合2010年《慢性乙型肝炎防治指南》診斷標準［5］，此前受試者均未核苷類藥物、干擾素抗病毒和免疫調節治療，排除甲、丙、丁、戊型肝炎病毒感染及酒精、藥物和自身免疫性肝病。

1.2 方法

1.2.1 檢測項目及試劑 ①血生化檢測：各觀察組患者均檢測血清AST、ALT、TP、Alb、A/G 比值、AFP 和TBA（總膽汁酸）。由寧波美康科技有限公司提供相應試劑盒。儀器為美國產雅培C-8000 全自動生化分析儀。②外周血清HBV DNA 含量的測定：收集患者血清，－70℃凍存至檢。采用熒光定量PCR 法（FQ-PCR）檢測患者血清HBV DNA含量，使用上海宏石全自動基因擴增儀，試劑盒由武漢百泰基因有限公司生產，試劑盒的最低檢出限度為500 IU/ml，線性范圍5.0×102～1.0×108IU/ml。③HBeAg 檢測：用于評價HBV PreC 區/BCP 區基因突變在臨床上的應用價值。HBeAg 檢測試劑盒由北京萬泰藥業股份有限公司生產。④HBV PreC 區/BCP 區基因突變：采用FQ-PCR 法檢測患者血清HBV PreC 區1896 位點突變和BCP 區1762／1764 雙位點突變。試劑為武漢百泰基因有限公司生產。儀器為上海宏基因擴增儀。

1.2.2 統計學方法 數據采用SPSS 15.0 統計軟件包進行分析處理，計量資料組間比較采用t檢驗，計數資料組間比較采用2檢驗。

2 結果

2.1 3組患者血生化檢測結果 見表1。由表1可見，與AsC組比較：CHB 組、CHB-LC 組患者血清ALT、AST、AFP、TBA 水平升高，差異有顯著性意義（P<0.01），呈顯著正相關；而TP、Alb、A/G 水平降低，差異有顯著性意義（P<0.05），呈負相關。

表1 3組患者血生化指標檢測結果比較（）

表1 3組患者血生化指標檢測結果比較（）

與AsC 組比較，▲ P<0.05，▲▲P<0.01

2.2 3 組患者外周血清HBVDNA 含量和HBeAg 定性檢測結果 見表2。由表2 可看出，HBeAg（－）可出現在慢性HBV 感染的不同病程，HBeAg（－）患者存在病毒復制。

表2 3 組患者HBV DNA 和HBeAg 檢測結果

2.3 HBV PreC 區/BCP 區基因突變檢測結果

2.3.1 HBeAg（+）組與HBeAg（－）組BCP 區與PreC 區突變分析 見表3。

表3 HBeAg（+）組HBeAg（－）組中BCP 區1762+1764 和PreC 區1896 突變分布［n(%)］

由表3 可見，HBeAg（+）組樣本中，BCP區的突變率均高于PreC區突變率，差異有顯著性意義（2=11.14，P<0.001）；HBeAg（－）組樣本中，BCP 區的突變率均高于PreC 區突變率，差異有顯著性意義（2=37.8，P<0.001）。

2.3.2 慢性HBV 感染不同臨床類型患者PreC 區/BCP 區變異的結果 見表4。

表4 HBV Pre C 區/BCP 區變異與不同臨床類型感染者的關系［n(%)］

由表4 可見，AsC 組、CHB 組、CHB-LD 組PreC 區1896、BCP 區1762/1764 變異率依次升高。與AsC 組比較：CHB 組PreC 區l896、BCP 區1762/1764 變異率升高，差異有顯著性意義，P<0.05；而CHB-LC 組差異有非常顯著性意義，P<0.01。

3 討論

HBV 屬嗜肝DNA病毒，其基因組長約3.2 kb，為部分雙鏈環狀DNA。HBV基因組主要包括4個開放讀碼框（ORF）分別位于S 區、C 區、P 區、X 區。PreC 區及C區位于同一個ORF 內，它們編碼兩種轉錄：前基因組RNA（pgRNA）和前C 區mRNA。HBV Pre C 區編碼前C 信號肽，引導HBeAg 前體至內質網，通過細胞分泌器加工處理后形成成熟的HBeAg 從肝細胞分泌出去；1862 位點G—T 的置換導致病毒前核心蛋白氨基酸密碼子的改變，變為終止密碼子，從而阻斷了HBeAg 的產生［6］。BCP是HBV復制的關鍵性調控因子，調控HBV 前C 基因組mRNA和前基因組mRNA轉錄；BCP 區的雙突變（1762，1764）可使3’端莖環結構發生改變，穩定性增強，促進病毒轉錄的發生和復制［7］，因此BCP 區的變異被視為影響病毒復制、HBeAg 表達的主要因素之一［8］。同時BCP 中的雙突變可能與活動性肝炎、肝硬化（LC）、原發性肝癌（HCC）相關［9］。

慢性HBV感染者病情輕重是由宿主和病毒兩方面所決定，許多研究都顯示C 基因變異與肝炎活動及嚴重性有關［10］。目前認為，有PreC 區變異的抗-HBe 陽性進展性肝炎（atypical type），這類患者HBeAg（－），HBVDNA（+），多有PreC區終止碼變異。當HBV PreC 區1896 G→A 變異后，使末端產生翻譯終止密碼子TAG，導致HBeAg 前體蛋白的合成中斷，造成HBeAg 減少或消失，但病毒本身復制不受影響。BCP 區的1762 位A→T 與1764 位G→A 雙變異可能引起嚴重慢性肝臟疾病［11］。

國內外學者在研究HBV Pre C 區/BCP 區基因突變多采用患者血清HBV DNA 提取、純化、測序、巢式PCR 擴增、限制性基因多態性片段確定基因位點突變，由于操作繁瑣，難于在臨床上推廣應用。我們采用武漢百泰基因有限公司生產的HBV Pre C 區1896 位點基因突變、BCP 區1762/1764 位點基因突變試劑盒，簡便、快速、準確應用于臨床。我們對慢性HBV 感染者中AsC 63例、CHB 82例、CHB-LC 20例進行分析，血清生化指標在慢性HBV 感染者病程進展中呈現相關性。其中ALT、AST、AFP、TBA水平升高，差異有顯著性意義（P<0.01），呈顯著正相關；而TP、Alb、A/G水平降低，差異有顯著性意義（P<0.05），呈負相關。與國內外報道相符。

AsC 組、CHB 組、CHB-LC 組HBV DNA 含量以及HBeAg檢測結果及HBeAg（+）組樣本中，BCP區的突變率均高于PreC區突變率，差異有顯著性意義（P<0.05）；HBeAg（－）組樣本中，BCP 區的突變率均高于PreC 區突變率，差異有非常顯著性意義（P<0.01）。提示HBeAg（－）慢性HBV 感染患者需要謹防HBV 復制的危險性。

PreC 區、BCP 區變異在AsC 組、CHB 組、CHB-LC 組發生率依次增高，不僅提示PreC區、BCP區變異可以預測慢性HBV感染者病情的發生發展程度，還可能出現肝臟惡變的可能性［12］。

隨著對HBV 基因型研究的深入，人們發現其基因型與基因變異之間似乎存在一定的相關性。例如A、F 基因型的HBV不易發生Pre C 區1896 突變，而其他基因型該位點的突變率較高。一些學者研究認為B 基因型HBV 的Pre C 區1896 位點較C 基因型更容易發生G→A 的突變，C 基因型感染者BCP 區雙突變率較B 基因型感染者高。即BCP 區突變率高與C 基因型分布多有關［13］。盡管近年來對HBV PreC 區、BCP 區基因變異的研究已經較為廣泛和深入，但HBV S 區、C 區、P 區、X 區也會出現基因突變，會影響慢性HBV感染者人群病程的變化；不同種族對基因突變的易感性也不同；患者自身免疫力，生存環境也會影響此類患者的病程。要對我國慢性HBV 感染人群監控，值得全社會去共同關心［14］。

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