馬糞海膽不同地區群體形態學比較研究*

劉成龍,曾曉起

(中國海洋大學,1.水產學院; 2.海洋生物多樣性與進化研究所，山東 青島 266003)

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馬糞海膽不同地區群體形態學比較研究*

劉成龍1，2,曾曉起1,2**

(中國海洋大學,1.水產學院; 2.海洋生物多樣性與進化研究所，山東 青島 266003)

運用單因子方差分析、主成分分析、聚類分析3種方法，對大連、威海、青島、嵊泗和南麂5個地區的馬糞海膽(Hemicentrotuspulcherrimus)群體(125只)的13個特征進行了比較分析。單因子方差分析結果顯示，大連、威海、青島地區的馬糞海膽樣品13組數據特征比值參數與另外2個地區的均差異顯著(P<0.05)；主成分分析結果顯示，貢獻率最大的3種主成份的累計貢獻率為75.599%；聚類分析結果顯示，大連、威海和青島地區馬糞海膽聚為一支，南麂地區的馬糞海膽與嵊泗地區的聚為一支；根據Mayr等提出的75%原則，大連、威海、青島地區的馬糞海膽和南麂、嵊泗地區的馬糞海膽的形態差異屬種內不同群體間的差異，未到亞種水平。

馬糞海膽；形態學；單因子方差分析；主成分分析；聚類分析

馬糞海膽(Hemicentrotuspulcherrimus)隸屬于拱齒目 (Camarodonta)、球海膽科 (Strongylocentrotidae)、馬糞海膽屬 (Hemicentrotus)，為我國和日本特有種，黃、渤海沿岸極為普遍，向南可到浙江和福建沿海[1]。

形態學比較研究法，又稱生物學測定方法，屬于傳統種群鑒別方法，是物種分類的基本方法之一，也是早期經典遺傳學研究物種遺傳變異的主要方法[2-4]。長期以來，物種分類、資源評價、物種起源和進化研究都是以形態標記為基本指標，到目前為止，形態指標依然是分類學研究的常用方法，并且已經得到了廣泛的應用[5-7]。 目前， 對海膽的研究主要集中于生物學、繁殖習性和細胞遺傳學等方面，在海膽的形態學分析上，張文峰進行了3種刻肋海膽分類的數量分析，利用形態學比較研究法對3種刻肋海膽形態學差異及分類關系做了研究，然而對于不同地域的馬糞海膽群體的形態學差異的研究尚未見報道[8-11]。

本研究對中國從北到南5個地區的馬糞海膽群體進行收集和形態學特征測量，結合統計比較方法，分析比較了這5個群體馬糞海膽的形態學差異。研究結果將為馬糞海膽的種群劃分及生物學研究提供基本資料，同時也為其群體遺傳學研究提供形態學依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

馬糞海膽樣品于2010年8月～2012年8月分別采自大連黑石礁、威海小石島、舟山嵊泗列島、溫州南麂列島和青島大公島，并依次縮寫為DL、WH、SS、NJ、QN以便后文表述(見圖1，表1)。樣品用5%的NaoH溶液煮沸，去表面棘保存備用。

圖1 馬糞海膽樣品采集地點Fig.1 sampling locations of Hemicentrotus pulcherrimus

1.2 實驗方法

1.2.1 形態學特征 本研究測定了13個量度特征：1：殼長，2：殼寬，3：殼高，4：口徑，5：步帶(赤道部)寬，6：間步帶(赤道部)寬，7：頂系長，8：頂系寬，9：圍肛部長，10：圍肛部寬，11：篩板寬，12：第5生殖板寬，13：第Ⅱ終板寬(見圖2)。

1.2.2 測量方案 測量殼體特征1～6采用游標卡尺度量，精確度0.01mm；頂系7～13采用連于Nikon SMZ8000型解剖鏡的Nikon DN100數碼相機拍照，用圖像分析軟件PHOTO SHOP cs4放大后按比例分析度量。

表1 樣品基本信息Table1 The basic information of samples

圖2 海膽量度特征圖示[11]Fig.2 Measurement of sea urchin body

1.3 數據處理

1.3.1 數據的標準化 為了消除因個體大小導致的形態學參數影響，將13組量度特征數值兩兩組合求其相互關系，參照李思發等的方法[12-13]，將測量數據轉化成對殼長的比值，故本研究將測得的13組形態學參數分別除以殼長進行標準化，得出12組量度比值數據(以A～L表示)。A：殼寬/殼長，B：殼高/殼長，C：口徑/殼長，D：步帶(赤道部)/殼長寬，E：間步帶(赤道部)寬/殼長，F：頂系長/殼長，G：頂系寬/殼長，H：圍肛部長/殼長，I：圍肛部寬/殼長，J：篩板寬/殼長，K：第5生殖板寬/殼長，L：第Ⅱ終板寬/殼長。

1.3.2 數據分析 運用軟件Excel 2007和SPSS19.0對以上12組標準化數據進行一下統計分析。

(1)主成分分析：運用SPSS19.0計算各主成分負荷值和貢獻率，并繪制城主成份散布圖。

(2)聚類分析：運用Excel 2007計算出5地區海膽12組數據的參數平均值，運用SPSS19.0的Square Euclidean距離和類間平局連鎖(Between-groups linkage)模型進行相似性聚類分析，并構建聚類樹。

(3)單因子方差分析(one-way ANOVA):運用Excel2007對數據錄入并進行標準化，將錄入數據導入SPSS19.0進行單因子方差分析，并進行多重比較。對符合方差齊性的量度特征采用LSD法，不符合方差齊性的數據采用Tamhane’s T2法。

(4) 差異性系數分析: 參照Mayr等提出的75 %識別與劃分的規則[14]。

用Mayr 差異系數公式來計算幾個群體對應性狀的差異程度的量化數值,并用C.D> 1.28 亞種差異標準來衡量幾個群體之間的差異程度。

2 結果與分析

2.1 主成份分析

貢獻率最大的主成分共計3項，累計貢獻率為75.60%(見表2)。其中，第1主成分貢獻率為46.616%，主要由F、G、J、K、H、L、E決定；第2主成分貢獻率為20.611%，主要由C、B、A組成；第3主成分貢獻率8.371%，主要由I決定。除此之外其余主成分貢獻率均較低。第1主成分主要反映了頂系結構的差異，第2主成分反映了殼形的差異，第3主成分主要反映了圍肛部的差異。

根據前3個主成分繪制主成分分析圖(見圖3)，從圖中可以看出，除青島群體外，其他4個群體馬糞海膽第1主成分上明顯分為2個組群，大連、威海馬糞海膽聚為一組，南麂、嵊泗馬糞海膽聚為一組。第2主成分也基本將這4組海膽區分開。將青島群體加入后，可見在第1主成分上，青島地區馬糞海膽與大連、威海地區馬糞海膽更為接近，但在第2主成分上青島地區馬糞海膽與其他4種馬糞海膽沒有明顯分別。

圖3 馬糞海膽形態參數前3個主成分分布圖Fig.3 Plot of first three principal components from PCA based on morphological characters of H.pulcherrimus species

表2 5個馬糞海膽群體的形態參數主成分分析的因子載荷值Table 2 Factor loadings of principal components extracted from morphological parameters of 5 groups H. pulcherrimu

Note:①Width of the test/Length of the test；②Height of the test/Length of the test；③Diameter of the peristome/Length of the test；④Maximum width of the ambulacrum/Length of the test；⑤Maximum width of the interambulacrum/Length of the test；⑥Length of the apical system/Length of the test；⑦Width of the madreporite/Length of the test；⑧Length of the periproct/Length of the test；⑨Width of the periproct/Length of the test；⑩Width of the madreporite/Length of the test；Width of genital plate 5/Length of the test；Width of ocular plate Ⅱ/Length of the test；Contributions ratio；Cumulative contribution ratio

2.2 聚類分析

運用SPSS軟件中的block距離和Between-groups linkage方法對變量間的相似性進行聚類分析，構建的聚類數如圖4所示，結果表明5個群體可分為2支，大連、威海和青島的馬糞海膽聚為一支，南麂與嵊泗的馬糞海膽聚為一支，其中青島的馬糞海膽與大連威海的又有所差異。

圖4 馬糞海膽13組形態參數平均值聚類樹Fig.4 Dendrogram of cluster based on means of morphometric character for H. pulcherrimus species

2.3 單因子方差分析

通過單因子方差分析顯示(見表3)，大連、威海、青島地區馬糞海膽的12組形態學參數與南麂、嵊泗地區差異性顯著(P<0.05)；其中大連與威海的形態學參數差異不顯著；大連與青島的樣品有4組差異顯著(P<0.05)(分別是F、G、K、L)；大連與南麂的樣品有7組數據差異顯著(P<0.05)(分別是B、F、G、H、I、K、L)；大連與嵊泗的樣品有8組數據差異顯著(P<0.05)(分別是B、F、G、H、I、J、K、L)；威海與青島的樣品有4組數據差異顯著(P<0.05)(分別是F、G、K、L)威海與南麂的樣品有9組數據差異顯著(P<0.05)(分別是：B、C、F、G、H、I、J、K、L)；威海與嵊泗的樣品參數有8組數據差異顯著(P<0.05)(分別是B、F、G、H、I、J、K、L)；青島與南麂的樣品有7組數據差異顯著(P<0.05)(分別是B、F、G、H、I、K、L)；青島與嵊泗的樣品有6種數據差異顯著(P<0.05)(分別是B、H、I、J、K、L)南麂與嵊泗的樣品數據有3組差異顯著(P<0.05)(分別是F、G、J)。

2.4 差異系數(C.D)

參照Mayr 等提出的75 %識別與劃分的規則,差異系數由下面公式求得:

C.D= ︱M1 -M2 ︱/(S1 +S2 )

式中:M1,M2 和S1,S2 分別對應于兩群體性狀的平均值和標準差。通過計算得出表4中的數據。

表3 5個馬糞海膽群體的12組形態參數的單因子方差分析(平均值±標準差，P<0.05)Table 3 One-wayANOVA for 12 morphometric parameter rs of 5 H. pulcherrimus species(mean±SD，P<0.05)

注：英文字母上標表示群體間差異程度，上標相同或包含關系表示差異不顯著，上標不同或交集關系表示差異顯著。Note: The superscript means the different among populations. The same superscripts or containing relation mean the differences are not significant; different superscript or intersection relation mean the differences are significant.

①Width of the test/Length of the test;②Height of the test/Length of the test;③Diameter of the peristome/Length of the test;④Maximum width of the ambulacrum/Length of the test;⑤Maximum width of the interambulacrum/Length of the test;⑥Length of the apical system/Length of the test;⑦Width of the apical system/Length of the test;⑧Length of the periproct/Length of the test;⑨Width of the periproct/Length of the test;⑩Width of the madreporite/Length of the test;Width of genital plate 5/Length of the test;Width of ocular plate Ⅱ/Length of the test

表4 不同群體形態特征的差異系數(C.D) 值Table 4 Coefficients of difference between the morphological characteristics of two populations for different pairs

3 討論

3.1 主成分分析和聚類分析結果

主成分分析是一種將原來多個彼此相關的指標轉換為新的、個數較少且相互獨立或不相關的綜合指標的方法，這種方法作為一種多變量分析方式，迄今為止已經成功運用于新物種的發現和確認中，該方法能夠直觀地反映各個體之間的相似程度[15-16]。由主成分分析結果可以看出5個地區所有樣本12個形態學指標可以歸納為3個主成分，累計貢獻率為75.599%，其中第1主成分荷載量達到46.616%。通過進一步分析可得，第1主成分由海膽頂系各測量數據組成，第2主成分主要由殼體各測量數據組成，這一結果也反映了主成份分析降維的數據處理方法。除嵊泗外其他四地的樣本在第1主成分和第2主成分上分散程度相當，不同地理群體樣本間能夠形成相對集中的組，說明2個地理群體已經產生一定程度的分化，分化主要體現在頂系結構上。

聚類分析是采用群體各個變量平均值來總體反映各群體之間相似性的分析方法[17]。通過聚類分析得出的結果可知，馬糞海膽的形態在不同采集地點的地理分布上產生了相似性聚類，這種聚類結果呈現出南北種分化的趨勢，聚類分析作為最直接反映群體相似性的分析方法，其分析結果表明北方黃渤海近岸地區馬糞海膽與東海近岸馬糞海膽形態上產生了分化，而海膽作為一種運動能力較弱的海洋無脊椎生物，這種差異可能與海區生境的長期不同導致。

3.2 單因子方差分析和差異系數

單因子方差分析(one-way ANOVA)是一種定性的統計方法，用來檢測單一因素影響的幾個彼此獨立的組是否來自正態分布的整體[18]。本實驗樣品采集均來自獨立的正態分布群體，所以適合單因子方差分析。分析結果顯示：大連和威海地區的馬糞海膽差異性不顯著(P>0.05)，南麂和嵊泗地區的馬糞海膽僅有4項形態學參數存在顯著差異(P<0.05)；大連、威海地區的馬糞海膽較之南麂、嵊泗地區的海膽樣品均有7～9 項形態學參數存在顯著差異(P<0.05)。在P<0.05的水平下12種形態學參數單因子方差分析的結果顯示，5個地區的馬糞海膽幾乎都存在個別形態學參數的顯著性差異，這表明了不同生境的馬糞海膽已產生了形態上的變化。在P<0.05的水平下，越多的形態學參數顯著性差異就說明形態分化的劇烈。由結果可以看出大連、威海、青島地區的馬糞海膽與南麂、嵊泗地區品種存在顯著差異，這也印證了聚類分析的結果。

分類學家一般把亞種作為最小的分類單位，但Mayr認為亞種還可以進一步分為不同的地理種群，從而進一步提出了75%規則，并確定了差異系數的概念，把1.28作為亞種的分類臨界值。當2個群體間形態差異系數>1.28時[19]，表明它們的差異達亞種以上水平，反之則是不同地理種群間的差異。從表3可以看出，5個群體馬糞海膽的差異系數小于亞種分類的臨界值1.28，因此它們之間的差異仍然是屬于不同地理種群的差異，還沒有上升到亞種水平。

4 結語

運用單因子方差分析、主成份分析、聚類分析3種方法，本研究對大連、威海、青島、嵊泗和南麂地區5個馬糞海膽(Hemicentrotuspulcherrimus)群體(125只)的13個特征進行了比較分析。3種方法結果顯示，大連和威海的馬糞海膽群體較為相似， 南麂與嵊泗的馬糞海膽群體較為相似，青島地區馬糞海膽的形態特征更偏向于大連威海馬糞海膽。不同地域的馬糞海膽群體表現出了較明顯的南北差異，且差異主要集中在頂系結構上。根據Mayr等提出的75%原則，大連、威海地區的馬糞海膽和南麂嵊泗的馬糞海膽的形態差異屬種內不同群體間的差異，未到亞種水平[20]。

形態學分析是一種傳統的物種歸類方法，但形態學分析法存在較大的主觀因素，對于一些個體結構區別較大的形態學參數，測量和比對誤差較大[21]。不同群體的分化乃至新物種的產生可能是由于遺傳變異，也可能是各種復雜的環境因素綜合導致[22]，僅僅從形態上很難對其進行客觀的判斷，同時也很難找到變異的原因。目前只有將形態、生態指標和分子標記等結合起來，才能更準確的描述不同種的差異，才能為不同地區馬糞海膽群體的分類地位提供客觀依據。

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責任編輯 朱寶象

A Comparative Study on the Morphological Characteristics of Hemicentrotus Pulcherrimus from Different Populations

LIU Cheng-Long1,2, ZENG Xiao-Qi1,2

(Ocean University of China, 1. College of Fisheries; 2. Institute of Evolution & Marine Biodiversity, Qingdao 266003, China)

Thirteen morphological characteristics of 125Hemicentrotuspulcherrimusindividuals from Weihai, Dalian, Qingdao, Shengsi and Nanji were measured and analyzed with multivariate analysis and one-way ANOVA, PAC (principal component analysis) and cluster analysis. The results of multivariate analysis and one-way ANOVA showed that there are significant difference (P<0.05) among populations in thirteen morphological characteristics. PAC figured out that the contribution radio of three principal components were 46.616%, 20.611% and 8.371%, respectively, and the cumulative contribution radio was 75.599%. Cluster analysis showed that Weihai, Dalian and Qingdao populations were close in morphological relationship, and Shengsi and Nanji populations were close in morphological relationship. According to the 75% rule proposed by Mayr, there are significant differences between Weihai, Dalian, Qingdao populations and Nanji, Shengsi populations were intraspecific and between populations, less than intersubspecific difference.

Hemicentrotuspulcherrimus；Morphology；one-way ANOVA；principal component analysis；cluster analysis

中央高校基本科研業務費專項(201262037;201362023)資助

2014-03-04;

2014-06-05

劉成龍(1988-)，男，碩士生。E-mail：haidaliucl@163.com

** 通訊作者： E-mail:zengxq@ouc.edu.cn

S917

A

1672-5174(2015)04-040-06

10.16441/j.cnki.hdxb.20140037