流行性感冒疫苗發展進程回顧及發展趨勢

王艷 劉艷麗

流行性感冒(influenza，簡稱流感)是由流感病毒引起的急性發熱性呼吸道傳染病，根據核糖蛋白抗原不同分為甲(A)、乙(B)、丙(C)三型流感病毒。其中甲(A)型最常見，可廣泛流行并人畜共患，同時會發生不定時的突變而衍生出新的病毒株，乙(B)型也會發生流行，但癥狀較輕，丙(C)型主要以散發出現，后兩種病毒無再分亞型。流感病毒毒株抗原易變性是流感肆虐不止的關鍵所在，流感蔓延的機制雖未能完全破解，當前流感的防治是個尚未解決的難題，一些抗病毒藥物中僅金剛烷胺和甲基金剛烷胺對甲型流感病毒有效，因其作用于甲型流感病毒的脫殼步驟，作用對象為M2蛋白。但這兩種藥物有較多的副作用，可引起中樞神經系統癥狀，因此必須慎用。目前接種流感疫苗是預防流感和控制其流行的一種最有效的措施。本文對當前流感疫苗的研究進程做簡要回顧。

1 流感疫苗發展進程回顧及現狀

1937年流感病毒在雞胚中培養成功;

1941年美國首次批準使用流感病毒滅活疫苗;

1943年美國開始在軍隊中使用并證實有效;

1945年美國開始廣泛應用;

1958年有人采用超速離心和層析技術研究成功進一步純化的雞胚全病毒滅活疫苗，多種裂解劑的研究使流感病毒裂解疫苗研制成功;

1968年裂解疫苗在美國首次被批準使用;

1976年英國首先在裂解疫苗基礎上又研制出毒粒亞單位(HA和NA)疫苗;

1980年英國首次批準使用，滅活流感疫苗從而擴展到其他國家。

2003年美國批準在5至49歲健康人群中主動免疫接種減毒流感疫苗(LAIV)，流感活疫苗成為預防流感的一種重要新選擇。

1.1 目前我國市場應用的流感疫苗

目前我國流感疫苗市場的疫苗有國產和進口裂解疫苗、適合于12歲以下兒童接種的亞單位疫苗、全病毒滅活疫苗(此疫苗不良反應較大，12歲以下兒童不能接種)三種類型［1-3］。

1.1.1 流感全病毒滅活疫苗:經國家藥品管理部門批準的流感病毒接種雞胚尿囊腔中，對收獲的尿囊液進行滅活和無菌處理［4］，再采用離心或柱層析方法進行濃縮、純化得到病毒原液，經過檢測合格后進行包裝即為流感全病毒滅活疫苗。由于其不良反應報道較多限制了其應用

1.1.2 流感病毒裂解疫苗:經國家藥品管理部門批準的流感病毒株、在全病毒滅活疫苗基礎上，將純化后的病毒進行裂解，超濾濃縮后的單價病毒合并液可采用柱色譜法或蔗糖密度區帶離心法進行純化，純化后的病毒裂解液經除菌過濾后，并加入適宜濃度的硫柳汞作為防腐劑，根據各單價病毒原液的血凝素含量，將各型流感病毒按同一血凝素含量進行配制。所以，該類型疫苗的使用范圍持續擴大，成為當前流感疫苗市場的主流。

1.1.3 亞單位型流感滅活疫苗:是在在裂解疫苗的基礎上，通過加入恰當的裂解試劑并選擇合適的裂解條件，將流感病毒膜蛋白毒粒亞單位(HA)和表面抗原(NA)裂解下來，然后進行純化。亞單位型流感滅活疫苗進行人體接種后可以刺激機體產生相應的抗體，其免疫效果與裂解疫苗相同，且具有較好的安全性，可用于兒童。但亞單位型流感滅活疫苗不能使接種者產生分泌性球蛋白，且對異型病毒的感染效果較差。

1.2 我國尚未上市的流感減毒活疫苗 流感減毒活疫苗由美國率先研究并獲得美國上市許可，其減毒活疫苗是三價冷適應流感病毒甲、乙型疫苗，由甲型H1N1、甲型H3N2和乙型病毒以相當的熒光聚焦單位(FFU)劑量組成。生產用毒株需要每年由國家衛生部門推薦的流行抗原進行匹配更新。該疫苗是通過一個簡單的注射裝置噴入鼻腔，易于操作，并且比需要注射使用的滅活流感疫苗更容易被兒童所接受。美國臨床觀察證明，該疫苗免疫原性和安全性與流感滅活疫苗相似，在兒童組中，其所對應的病毒株和變異株的免疫效果略優于滅活疫苗。流感減毒活疫苗的制備方式是用單獨的疫苗毒種接種9～11 d的無特定病原體SPF雞胚，產生大量的6∶2重配株的單價疫苗。通過2～3 d的培養后，收集雞胚尿囊液，離心澄清并加入緩沖液穩定，得到大量的單價疫苗。按照配方，3種單價毒株和SPG溶液混合一定比例濃度并填充至噴鼻腔裝置中。目前我國企業如中國生物技術、天壇生物等公司也在積極研究開發流感減毒活疫苗。

2 新型流感疫苗研發現狀

新型的流感疫苗種類繁多，主要的研究方向將新型的流感疫苗簡述為三類。

2.1 針對毒種變異方面開發的流感疫苗 多價疫苗的開發是個必然的趨勢。流感疫苗從1978年前的“二價”苗到現在的“三價”苗已經歷了35年。然而，自從2001-2002流感季節以來，2種不同的乙型流感(Victoria和 Yamagata)一直合并流行［5-9］，“四價”苗的出現，有助于預防兩種A型病毒，并覆蓋了第二種B型病毒株，保護針對2種A株和2種B株流感病毒株的感染，降低兒童、成人、老年人的發病率。證明多價疫苗研發的必然趨勢。

毒株抗原性變異導致流感疫苗病毒株每年都需更換，但從1933年首次分離以來，M2蛋白的基因序列沒有發生變化。而近來的研究表明，將M2蛋白通過桿狀病毒載體在sf9細胞中表達，表達產物經腹腔注射BLAB/c小鼠，各項指標均表明，以M2為成分的流感疫苗可以保護小鼠免受同型或異型流感病毒的致死攻擊。這就為科學家們提供了一個思路:用M2蛋白作為疫苗成分可預防所有的甲型流感病毒。

2.2 新的培養基質開發的流感疫苗 禽流感施虐對傳統流感疫苗培養基質雞胚供應的巨大沖擊，使傳統雞胚培養的方式受到雞胚來源不足的制約，難以在短時間內生產足夠的疫苗以滿足潛在流行或大流行的防控需求。改變傳統的疫苗培養基質的研究工作一直在進行，利用雞胚細胞、哺乳動物細胞以及人二倍體細胞進行流感病毒的培養研究均取得了較大的突破。MDCK細胞生產制備流感疫苗平臺技術已經形成并正在推廣［10］，采用細胞生產的疫苗在安全性和免疫性上與雞胚法相當，而在經濟性和時效性上則遠遠超出，顯示了良好的發展前景。

基因工程疫苗大體分為四類，一類是利用基因工程方法刪除與毒力有關的基因從而制備的基因缺失疫苗;另一類是將保護性抗原基因連接到相關載體上使之表達的載體疫苗;第三類是基因工程亞單位疫苗，HA基因工程疫苗是目前研究最多的基因工程亞單位疫苗;第四類疫苗為利用反基因操作技術制備的反基因工程疫苗。采用基因工程方法制備疫苗的技術日益成熟，使用該技術可以快速提煉有效成分，應用于疫苗生產。

2.3 針對提高疫苗安全性及免疫原性開發的流感疫苗 疫苗佐劑應用非常廣泛，為提高疫苗的免疫原性并在流感大流行時節約抗原量，佐劑的應用得到國內外的認可。傳統的疫苗佐劑仍是氫氧化鋁和磷酸鋁，但近年來，科學家們對疫苗佐劑的設計、研制和開發取得了許多進展，一些優秀的佐劑諸如MF59、LTK63、免疫刺激復合物(ISCOM)黏膜佐劑［11-13］、皂素佐劑等廣泛應用于疫苗研究。各項研究表明，佐劑疫苗在流感流行的大環境下，是增加疫苗的供應量提高免疫效果一個非常明顯有效的方法。

類病毒顆粒疫苗，最早，日本人稱該類疫苗為virosome vaccine［14］，也可稱之為 MDP-virosome vaccine。目前，很多生物技術公司采用基因工程等新技術進行該類疫苗的研發。美國Greffex公司宣布采用GREVAXTM技術，通過經改造的腺病毒載體，研發新型流感疫苗;Protein Science公司宣布采用桿狀病毒表達載體系統技術［15，16］，研發新型流感疫苗;加拿大 Medicago公司宣布研制出H7N9病毒樣顆粒(virus-like particle，VLP)疫苗［17-19］。該類疫苗的多處于臨床研究階段，國內未見公開報道，同樣也是國內流感疫苗市場未來幾年研發的方向。

核酸疫苗是將編碼一種免疫原基因的核酸克隆人表達載體［20］，該載體在細菌中擴增，質粒DNA純化后用于機體免疫，在細胞中表達目的蛋白，引起機體的免疫應答。目前，流感疫苗的目的基因主要針對NP蛋白和HA，利用DNA重組技術，可直接提取HA DNA和NA DNA用于機體免疫，動物試驗結果表明，核酸疫苗對保護動物抵御流感病毒的感染是一種既經濟又有效的方法［21］，但該類疫苗在人體上的應用還需要長期周密的研究和評估。

十余年以來，我國先后經歷了多次流感疫情的考驗，從 2003年人感染 H5N1禽流感、2009年甲型H1N1流感大流行到此次H7N9禽流感疫情，無論國際還是國內，疫苗研發能力顯著提高、研發周期明顯縮短。然而，我國疫苗基礎研究薄弱，技術儲備不足，與歐美發達國家在創新能力、研發投入力度和技術水平等方面仍存在較大差距。我國人口基數大，衛生條件相對落后，又是流感大流行的主要爆發地，因此，及時研發新型疫苗，做好技術準備，以提高疫苗生產能力，這是防控潛在流行或大流行的關鍵措施，對保障公眾健康、維護社會經濟穩定具有重要意義。

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