地黃梓醇對缺氧缺糖損傷的人胚胎腎臟細胞保護作用研究

陳靖 付彥君

地黃梓醇對缺氧缺糖損傷的人胚胎腎臟細胞保護作用研究

陳靖 付彥君

目的 研究梓醇對缺血細胞的保護作用機制。方法 通過連二亞硫酸鈉消除培養基中的氧,在37℃、5%CO2培養箱中,模擬缺血環境中的細胞損傷;再對對照組、模型組、梓醇低、中、高濃度組分別進行細胞存活率、總抗氧化能力(total antioxidant capacity,TAC)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)測定。結果 梓醇能顯著提高細胞存活率,且在5～20μmol/L呈劑量依賴性,與模型組比較,差異有統計學意義(P＜0.01);梓醇能顯著提高細胞培養液上清液中的TAC、SOD,降低LDH水平,且在5～20μmol/L呈劑量依賴性,與模型組比較,P＜0.01,有統計意義。結論 梓醇可以通過抗氧化損傷保護缺糖缺氧細胞。

梓醇; 缺糖; 缺氧; 細胞保護

【Key words】 Catalpol; Hypoglycemia; Hypoxia; Cell protection

地黃Rehmanniae glutinosa Libosch,為玄參科地黃屬多年生草本植物的地黃新鮮或干燥塊根,最早記載于《神農本草經》,傳統中醫認為其具有“滋陰補血,填精補髓”的功效[1],早在公元前718年的周朝時期就作為皇帝貢品和饋贈親友的佳品。目前也是中國重要的創匯產品之一,產品遠銷港澳、東南亞及日本等地區[2],臨床上常用于治療腦卒中,腦卒中后遺癥等[3]。梓醇是地黃的主要成分之一,《中華人民共和國藥典》(一部)2010版以梓醇含量來檢測生地黃質量[4]。近年研究發現,梓醇具有利尿、降血糖、抗腦缺血、保肝及保護神經元免受細胞毒性損傷,減少腦缺血后神經凋亡等藥理作用[5-7]。腦缺血時,大量細胞毒性成分誘導的氧自由基是導致細胞死亡的重要原因[8]。本文選用人胚胎腎臟細胞體外培養,通過測定對照組、模型組、和梓醇低、中、高濃度組的細胞存活率、總抗氧化能力(total antioxidant capacity,TAC)、超 氧化 物歧 化酶(superoxide dismutase,SOD)以及乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)活力,探討梓醇對細胞保護機制。

1 材料與方法

1.1 材料

10%胎牛血清RP-MI1640培養液購于Hyclone公司;Earle＇s平衡鹽溶液購于蘇州蘇大賽爾免疫生物技術有限公司;TAC試劑盒、SOD試劑盒、LDH試劑盒購自南京建成試劑公司;地黃梓醇(地黃提取物,含量大于98.5%)和人胚胎腎臟細胞由沈陽藥科大學藥學院提供;噻唑藍(MTT)溶液: 100 mg MTT固體充分溶解于20 m L磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L,pH 7.2),用0.22μm微孔濾膜過濾,4℃避光保存。

1.2 缺氧缺糖損傷模型的建立及實驗分組

實驗分為對照組,缺血缺氧損傷模型組和缺血缺氧損傷后藥物干預組。取前培養24小時的人胚胎腎臟細胞,吸去原培養液,并用Earle＇s液(pH 7.4)洗滌,調整細胞數目約1.5×105個/mL,接種于96孔板(0.1 mL/孔)。對照組加入20μL含糖Earle＇s液;模型組加入10μL連二亞硫酸鈉的無糖Earle＇s和10μL含糖Earle＇s溶液;梓醇低、中、高濃度組分別加入10μL連二亞硫酸鈉的無糖Earle＇s液和10μL的不同濃度藥物(5、10、 20μmol/L)。將培養板置于37℃、5%CO2培養箱中培養24小時后觀察并測定有關指標。

1.3 MTT法測定細胞存活率

取上述96孔板,每孔加入5 mg/mL的MTT溶液10μL,4小時后鏡下觀察結晶情況并每孔加入100μL三聯液(10%十二烷基硫酸鈉,5%異丁醇, 0.012 mmol/L HCl),再培養10小時左右后取出,于酶標儀640 nm為參考波長,560 nm波長測定吸光度(A)。

1.4 細胞培養上清液中 TAC、SOD及 LDH的測定

吸取各組細胞培養孔內的上清液作為測試液,按試劑盒說明書進行測定。

1.5 統計學處理

實驗結果用SPSS 20.0軟件進行處理,每組數據以均數±標準差(±s)表示,采用單因素方差分析(ANOVA),組間兩兩比較用SNK法,P＜0.05有統計學意義,P＜0.01有顯著差異。

2 實驗結果

2.1 梓醇對缺氧缺糖細胞存活率的影響

結果表明,在經過造模處理后,模型組細胞存活率降低,和對照組相比,差異有統計學意義(P＜0.01)。而梓醇低、中、高濃度組在給藥后,細胞存活率提高,與模型組對比,差異有統計學意義(P＜0.01)。梓醇對細胞的保護作用在5～20μmol/L時,明顯表現出劑量增大,保護作用增強,具體結果見表1。

表1 梓醇對缺氧缺糖細胞存活率的影響(±s,n=10)

注:與對照組比較:aP＜0.01;與模型組比較:bP＜0.01。

組別 濃度μmol/L A560細胞存活率(%) 0.121±0.002 100.00±1.31模型組 —— 0.015±0.003a12.40±1.64a梓醇低濃度組 5 0.035±0.003b29.93±1.34b梓醇中濃度組 10 0.052±0.001b42.50±0.08b梓醇高濃度組 20 0.062±0.002b51.24±1.42對照組 ——b

2.2 梓醇對缺氧缺糖細胞 TAC、SOD及 LDH的影響

結果表明,在經過造模處理后,模型組TAC、SOD含量降低,和對照組相比,差異有統計學意義(P＜0.01)。而梓醇低、中、高濃度組在給藥后,TAC提高,與模型組對比,差異有統計學意義(P＜0.01)。而模型組LDH含量升高,和對照組相比,差異有統計學意義(P＜0.01)。而梓醇低、中、高濃度組在給藥后,LDH含量降低,與模型組對比,差異有統計學意義(P＜0.01)。梓醇對細胞的保護作用在5～20μmol/L時,明顯表現出劑量增大,保護作用增強,具體結果見表2。

表2 梓醇對缺氧缺糖細胞TAC、SOD及LDH的影響(±s,n=10)

注:與對照組比較,aP＜0.01,與模型組比較,ybP＜0.01。

組別 濃度μmol/L TAC(U/mL) SOD(U/mL) LDH(U/mL) 21.51±0.53 29.51±1.53 821.51±122.53模型組 —— 2.62±0.43a4.62±1.43a1442.62±221.43a梓醇低濃度組 5 6.51±0.73b10.51±0.83b1206.51±121.73b梓醇中濃度組 10 7.98±0.51b14.98±1.51b1097.98±86.51b梓醇高濃度組 20 10.21±0.92b19.21±0.92b973.21±95.92對照組 ——b

3 討論

人胚胎腎臟細胞廣泛應用于藥物的細胞保護作用研究[9]。在細胞缺血損傷時,主要是因為細胞缺氧缺糖,繼而產生大量自由基,損傷細胞。本實驗的缺氧缺糖模型是利用連二亞硫酸鈉消除培養基中的氧,在37℃、5%CO2培養箱中培養24小時,模擬缺血環境中的細胞損傷,方法簡單,結果穩定、可靠[10]。

TAC是酶促體系小分子量的抗氧化物質和非酶促體系的抗氧化物質的總和,是反映機體抗氧化作用的重要指標。SOD能清除自由基,對機體的氧化與抗氧化平衡起重要作用。在組織缺血時,TAC和SOD活性降低,氧自由基堆積,氧自由基可轉變為羥基自由基,活性增強,損傷細胞膜結構,破壞細胞膜功能,進而加劇缺血組織損傷。LDH廣泛存在于細胞漿內,當細胞發生損傷時, LDH進入細胞外液,活性增高。因此,TAC、SOD水平和機體抗氧化能力呈正相關,LDH水平和機體損傷水平呈正相關。本實驗通過測定細胞存活率及細胞培養液上清液中的TAC、SOD、LDH等指標,證明了梓醇至少通過抗自由基損傷,抗氧化對細胞發揮保護作用,梓醇對細胞有保護作用,且保護作用和劑量(5～20μmol/L)呈正相關性。

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Study on protective effect of catalpol on injuried HEK293 cell induced by oxygen glucosedeprivation

CHEN Jing,FU Yan-jun. Experiment center for teaching,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110847,China

FU Yan-jun,E-mail:yjfukim@163.com

Objective To study the protectivemechanism of catalpol onchemic cells.M ethods By sodium dithionite and eliminatemedium oxygen at37℃,5%CO2incubator,cell damage of simulated ischemia environment.The cell survival rate,total antioxidant capacity(totalantioxidant capacity,TAC), superoxide dismutase(superoxide dismutase SOD)and lactate dehydrogenase(lactate,dehydrogenase, LDH)determination were compared among the control group,model group,low catalpol group,medium catalpol group and high catalpol group.Results Compared with model group,catalpol can significantly improve the survival rate of cells in a dose-dependentmanner(5～20 mol/L,P＜0.01).Compared with themodel group,catalpol can significantly improve the cell culture supernatant of TAC,SOD,reduce the LDH level with the same trend of survival rate of cells.Conclusion Catalpol can protect OGD cell oxidative damage.

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2015.09.010

2014-11-21)

(本文編輯:董歷華)

遼寧中醫藥大學校2011年度教育科學研究立項課題(七年制專項)

110847 沈陽,遼寧中醫藥大學教學實驗中心(陳靖),基礎醫學院基礎藥理教研室(付彥君)

陳靖(1979-),碩士,實驗師。研究方向:藥理學及中藥藥理學。E-mail:w2013007@126.com

付彥君(1966-),女,博士,副教授。研究方向:藥理學及中藥藥理學。E-mail:yjfukim@163.com