寬筋藤藥材UPLC特征圖譜研究

遲森森 韓丹 劉斌

·論著·

寬筋藤藥材UPLC特征圖譜研究

遲森森 韓丹 劉斌

目的 建立寬筋藤藥材的超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography, UPLC)特征圖譜,為寬筋藤藥材的整體質量分析和評價提供參考依據。方法 采用Waters Acquity C18色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.7μm),流動相0.1%甲酸乙腈溶液(A)-0.1%甲酸水溶液(B),梯度洗脫,流速為0.5 m L/min,柱溫為30℃ ,檢測波長為320 nm。采用聚類分析和特征圖譜相似度分析對16批不同地區的寬筋藤商品藥材UPLC特征圖譜進行評價。結果 建立了寬筋藤藥材的UPLC特征指紋圖譜共有模式,共標定了35個共有峰。聚類分析將16批寬筋藤商品藥材分為4類,特征圖譜經國家藥典規定的相似度計算軟件計算,整體相似度良好。結論 本研究建立的寬筋藤藥材特征圖譜的特征性和專屬性強,方法準確、可靠、重復性好,可用于寬筋藤藥材的整體質量控制和評價。

寬筋藤; 特征圖譜; 超高效液相色譜; 聚類分析; 質量控制

寬筋藤Tinosporae sinenisis(Lour.)Merr.來源于防己科植物中華青牛膽的干燥藤莖[1],具有祛風止痛,舒筋活絡的功效,中醫用其治療風濕痹痛,腰肌勞損,跌打損傷[2]。寬筋藤在藏醫藥中又名“勒哲”,《甘露之池》中記載“勒哲味甘、苦、澀、辛,化味甘、酸,性潤、涼、溫,治龍、赤巴合并癥、培根病、風濕病、風熱病”[3]。藥理研究表明寬筋藤藥材提取物具有抗氧化、抗炎、保肝和免疫調節等方面藥理活性[4-6],這是其所含的生物堿類、甾體類、萜類、香豆素類和氨基酸等成分協同作用的結果[2]。但目前國內有關寬筋藤藥材活性成分的研究報道比較少,缺乏整體性的化學表征。且其在廣東、海南、廣西和云南等地多有分布,各地區寬筋藤商品藥材品質差異未能有效區分,其質量控制標準幾乎處于空白階段。由于中藥化學成分的復雜多樣性,因此任何單一成分含量高低均不能準確完整的評價一味中藥的質量[7],基于此,本文采用超高效液相色譜法,建立多元梯度洗脫模式測定了16批寬筋藤商品藥材飲片的UPLC特征指紋圖譜,可從整體上表征寬筋藤藥材的成分信息,為其整體質量控制提供科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters Acquity超高效液相系統,包括二元高壓梯度泵、25μL可調進樣器、柱溫箱、PDA全波長檢測器和Waters Enprower 3色譜數據處理工作站(美國Waters公司);Sartorious BT 25S型十萬分之一電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司); KQ-500DE超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

寬筋藤藥材購自全國14個不同地區,分別為安國、成都、廣州、桂林、亳州、昆明、南京、梧州、武漢、新疆、玉林、湛江、青海和北京,共16批樣品,標號為S1～S16。乙腈(Sigma-aldrich公司,色譜純),試驗用水均為娃哈哈純凈水,其他試劑均為分析純;所有試劑用前均經0.22μm微孔濾膜濾過。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱為 Waters Acquity C18柱(2.1 mm×50 mm,1.7μm),PDA檢測器,流動相為0.1%甲酸乙腈溶液(A)-0.1%甲酸水溶液(B),采用梯度洗脫(0.0～3.0分鐘,5%A;3.0～6.0分鐘,5%～7.9% A;6.0～7.5分鐘,7.9%～8.3%A;7.5～9.0分鐘, 8.3%～9.2%A;9.0～10.5分鐘,9.2% ～9.6% A;10.5～14.5分鐘,9.6%～14.4%A;14.5～17.0分鐘,14.4% ～16.2% A;17.0 ～19.0分鐘, 16.2%～18.8%A;19.0～24.0分鐘,18.8% ～25.0% A;24.0～25.0分鐘,25.0% ～25.5%A),柱溫30℃,流速0.5 mL/min,檢測波長320 nm,進樣量2μL。

2.2 樣品溶液的制備

取寬筋藤藥材粉末(60目)約1 g,精密稱定,置100 mL具塞錐形瓶中,精密加入甲醇80 mL,稱定重量,超聲(功率250 W,頻率20 KHz)提取30分鐘,搖勻,放冷,稱重,用甲醇補足減失的重量,過濾。濾液減壓回收溶劑至干,殘留物用甲醇溶解并定容至2 mL,經0.22μm微孔濾膜濾過,取續濾液作為供試品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液,連續進樣6次,按“2.1”項下色譜條件進行檢測,記錄各共有峰保留時間和峰面積,以峰19(tR=17.532分鐘)為參照物,計算結果顯示35個共有峰相對保留時間RSD在0.02%～0.84%之間,相對峰面積RSD在0.51% ～2.82%之間,表明儀器精密度良好,符合指紋圖譜檢測要求。

2.3.2 穩定性試驗 精密吸取同一批供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件分別于制備后0,3,6,9,12, 24小時進行檢測,記錄各共有峰保留時間和峰面積,以峰19(tR=17.532分鐘)為參照物,計算結果顯示35個共有峰相對保留時間RSD在0.04%～0.95%之間,相對峰面積RSD在0.48%～2.93%之間,表明樣品在24小時內穩定性良好。

2.3.3 重復性試驗 取同一批次寬筋藤藥材粉末(60目)6份,每份約1 g,精密稱定,按“2.2樣品溶液的制備”項下方法制備供試品液,按“2.1”項下色譜條件進行檢測,記錄各共有峰保留時間和峰面積,以峰19(tR=17.532分鐘)為參照物,計算結果顯示35個共有峰相對保留時間RSD在0.01%～0.34%之間,相對峰面積RSD在0.70%～2.99%之間,表明該方法重復性良好。

2.4 寬筋藤特征圖譜的構建和解析

2.4.1 寬筋藤共有峰的確定 取14個不同地區16批寬筋藤商品藥材樣品,按“2.2樣品溶液的制備”項下方法制備供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件對各批寬筋藤藥材進行分析檢測,記錄各色譜峰保留時間和峰面積。確定在16批寬筋藤特征圖譜中出峰時間基本一致、峰面積較大的35個峰為共有特征色譜峰,其共有峰面積之和均占原有色譜圖所有峰面積的90%以上,結果見圖1、2。其中19號峰(tR=17.532分鐘)分離度較好,且保留時間和峰面積適中,因此選擇19號峰作為內參比峰,計算其他各色譜峰對內參比峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示各共有峰相對保留時間的RSD值在0.01%～1.06%之間,說明16批樣品之間的共有模式穩定,而相對峰面積的RSD值則比較大,說明不同批次寬筋藤商品藥材之間的質量存在一定差異。

2.4.2 聚類分析 將16批寬筋藤商品藥材的UPLC圖譜中共有峰的峰面積值標準化處理,運用SPSS 16.0軟件對其進行系統聚類分析,采用組間連接法,利用歐式距離作為樣品的測度,可將樣品分為4類,結果見圖3。聚類分析結果表明寬筋藤商品藥材質量差異在全國分布無明顯地域特征,但在一些相鄰的省份藥材質量較為相似。S9和S7,S13和S4分別在同一類中,可能是寬筋藤作為民族藥,主產于廣州、廣西、云南三省南部。S1、S16、S6、S8均在同一類中,則可能是由于安國和亳州為中藥材市場的聚集地,而北京和南京分別緊鄰這兩個城市,購買地相似所致。S15、S2、S11均在同一類中,可能是這3批藥材的購買地都地處中國的西部,貨源相似。

2.4.3 特征圖譜相似度計算 采用國家藥典委員會《中藥色譜特征圖譜相似度評價系統(2004A)》對16批寬筋藤商品藥材的UPLC圖譜進行相似度分析,以所建立的寬筋藤特征圖譜共有峰作為參照,分別進行時間窗的設定、譜峰匹配,進行相似度計算,結果見表1。由表1可知,16批寬筋藤商品藥材相似度在0.779～0.969之間,其中11批商品藥材相似度在0.900以上,藥材質量較好。而購自安國、桂林、新疆、北京和湛江的寬筋藤商品藥材相似度在0.779～0.879之間,藥材質量一般。

3 討論

通過對提取方式(超聲、加熱回流),藥材粉碎度(40、60、80目),提取溶劑(甲醇、70%甲醇、50%甲醇),溶劑倍量(10、20、40、80、160倍量),提取時間(15、30、45、60分鐘)進行考察,最終確定寬筋藤藥材提取方法為:藥材粉碎至60目,加入80倍量甲醇溶液,超聲提取30分鐘(功率250W,頻率20 KHz)。

分別考察了乙腈-水、0.1%甲酸乙腈溶液、0.1%甲酸乙腈溶液-0.1%甲酸水溶液3個流動相系統,結果表明采用0.1%甲酸乙腈溶液-0.1%甲酸水溶液流動相系統,各峰分離度較好,且基線平穩,最有利于特征圖譜的分析。同時采用Waters二級管陣列檢測器對檢測波長進行了選擇,通過比較254 nm、320 nm和340 nm檢測波長下的色譜圖,以圖譜提供的色譜峰的信息量和峰面積為考察指標,發現在320 nm波長下,色譜峰信息量最大,因此選擇320 nm為檢測波長。

在中藥色譜特征圖譜相似度評價系統(2004A版)的輔助下,得出了寬筋藤藥材的UPLC對照特征圖譜。比較16批寬筋藤商品藥材特征圖譜后發現,不同地區寬筋藤藥材特征圖譜中主要峰群的整體圖貌基本一致,相似度在0.779～0.969之間,說明不同地區藥材中各成分含量的相對比值有所差別。這種在共性特征基礎上存在的個體差異是常見的現象,因為藥材生產過程中受到土壤、氣候、環境因素及采收加工過程中很多因素的影響,通過量化比較可以為選購原料藥材及指導GAP提供質量信息。

特征圖譜是目前控制中藥材質量最有效、最直觀的手段之一。有關寬筋藤藥材的質量控制在中國藥典和各地方藥材質量標準中沒有詳細的規定。本文采用UPLC方法,建立了寬筋藤藥材的特征圖譜。結果表明該方法穩定、可靠、重現性好,可為寬筋藤藥材質量分析、評價與控制提供依據。

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[3] 江蘇新醫學院編輯委員會.中藥大辭典(上冊)[M].上海:人民出版社,1977:219,1139,1393.

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Study on UPLC specific chrom atogram of caulis tinosporae sinenisis

CHISen-sen,HAN Dan,LIUBin. School ofChinese Materia Medica,Beijing University ofChinese Medicine,Beijing 100102,China Corresponding author:LIU Bin,E-mail:liubinyn67@163.com

Objective To establish the ultra performance liquid chromatography(UPLC)specific chromatogram of caulis tinosporae sinenisis,in order to provide reference basis for overall quality analysis and evaluation of caulis tinosporae sinenisis.M ethods Analysiswas performed on theWaters Acquity C18column(2.1mm×50mm,1.7μm),the acetonitrilewith 0.1%formic acid(A)-0.1%formic acid(B) was adopted asmobile phase in gradient elution mode,and monitored under 320 nm wavelength.The flow rate was set at 0.5 mL/min and the column temperature was set at 30℃.Sixteen batches of caulis tinosporae sinenisismedicinalmaterial samples collected from different areaswere analyzed by hierarchical clustering analysis(HCA)and similarity analysis(SA)to evaluate the UPLC specific chromatogram. Results Thirty-five common peaks were selected to establish the UPLC specific chromatogram of caulis tinosporae sinenisis.Sixteen batches ofmedicinalmaterial sampleswere classified as four clusters by HCA and a good overall similarity was calculated by the overall similarity software specified in the national pharmacopeia.Conclusions The established method for specific chromatogram by UPLC with better characteristic and specificity was accurate,reliable and repeatable,which could be applied to the overall quality control and evaluation of caulis tinosporae sinenisis.

Caulis tinosporae sinenisis; Specific chromatogram; UPLC; Hierarchical cluster analysis; Quality control

R284.1

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2015.09.013

2015-02-02)

(本文編輯:董歷華)

北京中醫藥大學自主選題(2013-JYBZZ-XS-116)

100102 北京中醫藥大學中藥學院[遲森森(碩士研究生)、韓丹、劉斌]

遲森森(1990-),女,2014級在讀碩士研究生。研究方向:中藥(復方)有效成分(組分)發現與新藥創制。E-mail: m17801085298@163.com

劉斌(1967-),博士,教授。研究方向:中藥(復方)有效成分(組分)發現與新藥創制。E-mail:liubinyn67@163.com