高血壓頸動脈斑塊陽性患者miR—375表達檢測

李鴻翔　李近都　梁燁　李天資　藍家富　李清鋒

【摘要】目的探討miR-375在高血壓頸動脈斑塊陽性患者的表達變化情況及其臨床意義。方法檢測23例高血壓頸動脈斑塊陽性患者（實驗組）的血壓和血清miR-375表達水平，并與12例健康者（對照組）比較。結果實驗組的收縮壓、舒張壓、頸動脈內中膜厚度（IMT）和miR-375表達平均水平分別為（170.4±6.0）mmHg、（106.3±8.7）mmHg、（1.28±0.08）mm和（3.53±0.77），對照組分別為（132.2±3.8）mmHg、（86.4±6.6）mmHg、（0.83±0.17）mm和（2.36±0.76），實驗組的收縮壓和舒張壓平均水平明顯高于對照組（P<001），miR-375表達的平均水平也明顯高于對照組（P<0.01）。結論miR-375或許作為致病因素，而不是保護因素參與高血壓頸動脈斑塊陽性疾病的發生和發展，miR-375過高表達對高血壓頸動脈斑塊陽性患者疾病可能有促進作用。

【關鍵詞】原發性高血壓；頸動脈斑塊陽性；miR-375；基因調控

中圖分類號：R544.1 文獻標識碼：ADOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2015.01.004

高血壓頸動脈斑塊陽性是慢性血管疾病的重要危險因素之一，其與慢性血管事件關系密切，研究表明，高血壓及其動脈粥樣硬化的發病率和患病率呈快速增長趨勢，嚴重威脅居民的生命健康，備受關注[1]。miR-375是一類特異性高表達于胰腺組織的非編碼小RNA，通過轉錄因子（NF-κB）和肌侵蛋白（myotrophin，MTPN）調控血管細胞的病理和生理，維持動脈的正常機能，miRNA表達水平對其與靶基因結合的效率及其轉錄的活性有影響，并與動脈粥樣硬化的發生和發展相關聯[2～7]。為探討高血壓頸動脈斑塊陽性患者與miR-375表達水平的關聯性，本項研究檢測了23例高血壓患者（實驗組）的頸動脈內中膜厚度（IMT）和血清miR-375表達水平，并與12例健康者（對照組）比較，結果報道如下。1對象與方法1.1研究對象選取2014年1～5月在我院體檢部接受體檢者，符合下列條件：①連續2天檢測符合下列條件為患者：收縮壓≥140 mmHg或舒張壓≥90 mmHg即可診斷為高血壓[8]；②頸動脈超聲測量頸總動脈（CCA）、頸內動脈（ICA）、頸外動脈（ECA）內IMT，其中IMT≥1.2 mm，≤1.4 mm者為斑塊陽性。③排除血栓出血性疾病、糖尿病、免疫性疾病、嚴重感染、腫瘤、慢性中毒、繼發性高血壓。并經閱讀《臨床實驗觀察須知》，充分了解治療方法及其觀察措施，理解可能存在的風險，愿意配合治療和觀察，簽署《同意書》者入選為實驗組，共23例，男13例，女10例，年齡50～60（54.5±3.0）歲。對照組12例，男7例，女5例，年齡51～59（54.3±3.0）歲，收縮壓<140 mmHg并舒張壓<90 mmHg，頸動脈超聲測量CCA、ECA、ICA內IMT，IMT<1.0 mm。

1.2 方法①血壓測量：使用經過驗證的電子血壓計，氣囊長22～26 cm、寬12 cm的標準規格袖帶。受試者應至少坐位安靜休息5分鐘，30分鐘內禁止吸煙或飲咖啡，排空膀胱，取坐靠背椅，裸露上臂，上臂置于心臟水平，以Korotkoff第I音和消失音確定收縮壓和舒張壓水平。至少間隔5分鐘再測量1次，取2次讀數的平均值記錄。如果2次血壓值讀數相差≥5 mmHg，應再次測量，取3次讀數的平均值記錄。②頸動脈超聲檢查用儀器ALOKA-α10型超聲顯像系統，探頭頻率為7.5 MHz。受檢者取仰臥位，頭略向后伸，轉向被查的對側，充分暴露頸部。先從鎖骨內側端橫向檢查頸總動脈，然后沿胸鎖乳突肌外緣縱切掃查，依次顯示CCA、ICA、ECA和椎動脈（VA）。

1.3 標本的采集與處置研究對象空腹10 h以上于早晨7：00～8：00采集靜脈血，用靜脈真空采血管（BD 762165 PAX gene Blood RNA Tube，由上海華雅思創生物科技有限公司提供）采全血4 ml，血樣采集后，立即將采血管上下顛倒10次混勻，并于18℃～25℃正立放置至少2 h。先于-20℃放置24 h，然后轉移至-80℃保存，于1 M內用RN23 RNA liquid超速全血（液體樣本）總RNA提取試劑盒提取RNA。

1.4實時熒光定量PCR檢測 miR-375的表達轉染48 h后，用Trizol試劑法提取總RNA。A260/A280為1.8～2.0之間方可用于檢測。取500 ng總RNA做逆轉錄反應。試劑盒提供RT及qPCR通用引物，操作步驟按試劑盒說明書進行。反應總體積為10 μL，包含cDNA模板1 μL（1∶10稀釋）、qPCR通用引物1 μL，反應條件：95℃變性3 min，95℃作用5 s，62℃作用35 s，共40個循環，以U6為內參照，結果分析采用2-△△Q方法，以此值表示miR-375的表達水平。反應結束后由配套的計算機軟件計算各反應管內的Ct值。miRNA的表達水平采用相對定量方法，以2-ΔΔCt表示每個miRNA的變化倍數，再將結果轉化為對數形式，ΔCt=CtmiRNA-CtU6（以此表示相對表達量），ΔΔCt=ΔCt（高血壓組）-ΔCt（對照組）。

1.5 儀器和試劑盒 儀器：德國Biometra Tpersonal PCR，由上海恒久醫療器械有限公司提供；美國應用生物系統公司（Applied Biosystems

？倕 ）實時PCR擴增儀Step OnePlusTM，由愛普拜斯應用生物系統貿易（上海）有限公司提供。試劑盒：miRcute miRNA提取分離試劑盒、miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒，均由上海江萊生物科技有限公司提供。所用化學試劑均為分析純。

1.6 miRNA-375的表達檢測 用qRT-PCR法：按miR-cute miRNA（吸附柱法）提取分離試劑盒、miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒說明書操作。引物序列由Prime premier 5.0軟件自行設計，miR-375上游引物CCCTCTAGACCCCAAGGCTGATGCTGAGAAG，下游引物AAAGGTCCGCCGCCCGGCCCCGGGTCTTC。endprint

1.7統計學方法采用SPSS 17.0統計軟件，計量資料組間比較用兩獨立樣本均數t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。2結果實驗組的收縮壓和舒張壓平均水平明顯高于對照組（P<0.01），miR-375表達的平均水平也明顯高于對照組（P<0.01），miR-375與IMT相關性分析結果為：r=0.580，t=3.364，P=0.002，提示miR-375或許作為致病因素，而不是保護因素參與高血壓頸動脈斑塊陽性疾病的發生和發展。見表1。

表1兩組血壓、IMT與miR-375表達水平比較（±s）

組別n收縮壓（mmHg）舒張壓（mmHg）IMT（mm）miR-375實驗組23170.4±6.0106.3±8.71.28±0.083.53±0.77對照組12132.2±3.886.4±6.60.83±0.172.36±0.76t-19.8906.93410.7504.269P-0.0000.0000.0000.000

3討論miR-375是近年發現的非編碼小RNA，起初認為miR-375直接調控胰島組織中特異性轉錄因子的表達，參與調控基因及信號轉導通路，影響糖、脂代謝，對胰腺的形態、發育和功能有重要的作用。新近研究發現，miR-375的靶基因和靶蛋白比較多，調控網絡比較復雜，目前認為miR-375在高血壓的發生和發展過程中扮演著重要的角色。肌侵蛋白可與NF-κB相互作用，從而執行調節NF-κB活性的作用。而肌侵蛋白誘導的高血壓血管細胞的生長又由活化的NF-κB途徑介導。肌侵蛋白誘導的血管細胞的生長與NF-κB的結合和活化密切相關，提示肌侵蛋白激活NF-κB的核轉運，并且活化了高血壓基因的表達[9～11]。高血壓頸動脈斑塊陽性患者長時間血壓升高引起的動脈增生性病變，導致動脈管壁增厚、僵硬而失去彈性和（或）管腔狹窄，由于其血液對血管壁的側壓力增加，損傷血管內膜，平滑肌細胞變性，血漿脂質滲入血管內膜細胞，形成血管粥樣硬化，因此肌侵蛋白被認為是動脈粥樣硬化起重要作用的效應因子[12]。NF-κB通過調節其靶基因的表達，在機體免疫應答、炎癥及本病的發生發展過程中發揮著重要功能，NF-кB作為炎性反應相關轉錄因子，在動脈粥樣硬化中對白細胞介素-8和血管內皮生長因子的異常表達具有重要的啟動作用[13～16]。

本研究結果顯示，高血壓頸動脈斑塊陽性患者miR-375表達的平均水平明顯高于對照組（P<001），miR-375與IMT密切相關，提示miR-375或許作為致病因素，而不是保護因素參與高血壓頸動脈斑塊陽性疾病的發生和發展，其過高表達對高血壓頸動脈斑塊陽性疾病可能有促進作用，本課題組認為，進一步挖掘miR-375及其在高血壓頸動脈斑塊陽性疾病中的調控機制，尋找miR-375的調控基因以及靶基因，以miR-375為靶點設計小分子物質拮抗miR-375的作用，或許可以作為治療高血壓病的藥用靶向，對提高本病的防治效果，保障患者的生命質量等有重要意義。參考文獻[1] Lahmy R，Soleimani M，Sanati MH，et al.MiRNA-375 promotes beta pancreatic differentiation in human induced pluripotent stem （hiPS） cells[J].Mol Biol Rep，2014，41（4）：2055-2066.

[2] 李鴻翔，梁燁，李天資，等.原發性高血壓危險因素的易感基因及其非編碼RNA研究進展[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2014，12（7）：879-881.

[3] 陸克興，李天資，潘興壽，等.胰島素抵抗與血脂異常研究進展[J].右江醫學，2006， 34（4）：425-426.

[4] 李天資，潘興壽，藍景生，等.老年高血壓伴高尿酸血癥患者血小板活化與纖溶功能的變化[J].第三軍醫大學學報，2010，32（22）：2465-2467..

[5] Shaer A，Azarpira N，Vahdati A，et al.miR-375 induces human decidua basalis-derived stromal cells to become insulin-producing cells[J].Cell Mol Biol Lett， 2014，19（3）：483-499.

[6] 李天資，陸克興，潘興壽，等.原發性高血壓患者胰島素水平與職業的關系[J].中華預防醫學雜志，2008，27（3）：488.

[7] Shaer A，Azarpira N，Karimi MH.Differentiation of human induced pluripotent stem cells into insulin-like cell clusters with miR-186 and miR-375 by using chemical transfection[J].Appl Biochem Biotechnol，2014，174（1）：242-258.

[8] 李天資.現代內科醫學心血管分冊[M].北京：中國科學技術出版社，2010：277-289.

[9] Tattikota SG，Rathjen T，McAnulty SJ，et al.Argonaute2 mediates compensatory expansion of the pancreatic β cell[J].Cell Metab，2014，19（1）：122-134.

[10] 李天資，梁燁，許曉萍，等.廣西百色市高血壓伴高尿酸血癥患病率及其與超重血糖血脂血尿酸關系的研究[J].中華風濕病學雜志，2011，15（10）：749-754.

[11] Dumortier O，Hinault C，Gautier N，et al. Maternal protein restriction leads to pancreatic failure in offspring： role of misexpressed microRNA-375[J].Diabetes，2014，63（10）：3416-3427.

[12] 潘興壽，梁燁，李天資，等.野芭蕉輔助治療高血壓伴穩定勞力型心絞痛PCI術后患者炎癥反應療效觀察[J].時珍國醫國藥，2014，25（9）：2171-2173.

[13] 梁燁，李天資，陸高翔，等.野芭蕉通絡湯對改善高血壓患者氧化應激功能紊亂療效觀察[J].中華中醫藥雜志，2012，27（7）：1967-1969.

[14] 梁燁，李天資，陸高翔，等.野芭蕉治療自發性高血壓大鼠療效機理的實驗研究[J].時珍國醫國藥，2013，24（10）：2324-2326.

[15] 李天資，梁燁，陸高翔，等.野芭蕉治療高血壓頸動脈斑塊陽性患者療效機制的臨床研究[J].時珍國醫國藥，2012，23（9）：2259-2260.

[16] 黃恩贊，楊發奮，梁燁，等.野芭蕉茶飲者血壓血脂血糖和血尿酸水平的變化及其臨床意義[J].右江醫學，2014，42（5）：518-520..

（收稿日期：2014-12-05 修回日期：2015-01-27）

（編輯：潘明志）endprint