IL-12和IL-17強直性脊柱炎患者的外周血表達水平及兩者之間相關性研究

張 立，王 麗，李建平，楊 曉，王蒙蒙，蔡國旗，徐 彬，徐勝前，劉 萍，潘發明

◇臨床醫學研究◇

IL-12和IL-17強直性脊柱炎患者的外周血表達水平及兩者之間相關性研究

張 立1，王 麗2，李建平1，楊 曉2，王蒙蒙2，蔡國旗2，徐 彬1，徐勝前3，劉 萍1，潘發明2

目的檢測強直性脊柱炎（AS）患者白細胞介素-12（IL-12）、白細胞介素-17（IL-17）在外周血的分子水平和mRNA相對表達水平，探討其在AS發病的作用。方法采用ELISA、RT-qPCR法，分別檢測45例AS患者和45例健康對照者血清IL-12、IL-17分子水平及其在外周血單個核細胞中mRNA相對表達水平。結果病例組血清IL-12、IL-17水平顯著高于對照組（P＜0.05），病例組IL-12 mRNA、IL-17 mRNA相對表達含量顯著高于對照組（P＜0.05）；IL-12血清水平和IL-12 mRNA分別與IL-17血清水平和IL-17 mRNA呈正相關性。結論IL-12和IL-17在AS患者中是相關聯的分子，可能在AS發病機制中起重要作用。

白介素12；白介素17；強直性脊柱炎；血清水平；mRNA水平

強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一種慢性炎癥性自身免疫性疾病，其特點是類風濕因子陰性，炎癥累及脊椎等中軸關節和肌腱韌帶、骨附著點。AS的發病率在白種人中約為1‰～3‰，黃種人中約為3‰，該病發病高峰為20～30歲，多為青壯年，發病隱匿、進展緩慢，嚴重可致患者喪失勞動能力［1］。AS病因及發病機制目前尚不明確，其可能與遺傳、慢性感染、自身免疫功能紊亂和內分泌失調等因素有關。機體的免疫功能異常在該病發病中發揮著重要作用，其中T細胞的免疫功能異常在該病發病中的作用得到了廣泛的重視［2］。白細胞介素12（interleukin-12，IL-12）是一種具有多種重要生物學活性的促炎癥性細胞因子，參與機體免疫調節，功能性連接天然免疫和獲得性免疫，在腫瘤免疫、感染免疫及自身免疫中都發揮著重要的作用。課題組前期研究［3］顯示AS患者IL-17與IL-23的含量顯著高于健康對照者。而IL-12是與IL-23相關的一個細胞因子，其可能與輔助性T細胞17（Th17）細胞的分化與增殖有一定的關系［4］。研究［5］顯示，IL-12可能作用于IL-23R+CD4+T細胞，通過刺激這些細胞，使其分泌大量的IL-17，從而作用于自身免疫性疾病的發生發展。此外，IL-12B基因的一個單核苷酸多態性位點（rs6556416）的突變會導致血清中IL-12的升高，通過一系列的刺激，使得血清IL-17分泌的升高，增強炎癥反應［6］。為探討AS患者IL-12與IL-17的表達及兩者之間的關聯，該研究檢測AS患者和健康對照者血清中IL-12和IL-17的含量，進一步檢測外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中IL-12和IL-17 mRNA水平，并分析兩者之間的相關性，同時結合臨床特征進行相關分析。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取2014年4月～9月于安徽醫科大學第一附屬醫院風濕免疫科門診治療的AS患者45例作為病例組。所有的AS患者由兩名具有副主任以上職稱的風濕科醫師進行確診，按1984年美國風濕病學會修訂的紐約標準。病例組還需滿足：未合并其他慢性炎癥性疾病；近期無急性感染；無腫瘤史；不處于妊娠期或哺乳期。對照組按照年齡、性別進行匹配，在合肥市血液中心收集45例健康志愿者。其選擇標準為：未患重大疾病及沒有疾病家族史；自身無慢性疾病史；直系親屬沒有自身免疫性疾病家族史；最近1個月內未診斷患任何疾病，身體健康。根據強直性脊柱炎疾病活動指數（bath ankylosing spondylitis disease activity index，BASDAI）評分來劃分AS病情活動組和穩定組，得分范圍為0～10分，得分越高表明疾病越嚴重。將AS患者的BASDAI評分≥4分劃分為病情活動組，BASDAI評分＜4分劃分為病情穩定組。所有受試者簽署知情同意書，并報倫理委員會批準。

1.2 樣本的準備受試對象抽取外周血液5 ml，2 000 r／min離心10 min，取血清儲存于-80℃備用。剩余標本使用人淋巴細胞分離液分離出PBMCs，加入1 ml的TRIzol試劑，-80℃冰箱保存備用。使用TRIzol氯仿法提取總RNA，使用Nano-Drop2000微量紫外分光光度計測量總RNA濃度及純度，測量光密度（optical density，OD）值，選擇OD260／OD280在1.7～2.0之間的樣本使用。使用廣州復能基因逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄成cDNA，按照使用說明書配制成25 μl反應體系，置于普通PCR機進行反應，逆轉錄后的cDNA，置于-20℃保存，用于RT-qPCR法檢測。

1.3 RT-qPCR和ELISA法檢測運用SYBR? Green法，按照All-in-OneTMmRNA qRT-PCR Detection Kit說明書配制20 μl反應體系，反應使用vii7高通量PCR儀進行，反應條件：95℃預變性10 min，95℃變性10 s，60℃、20 s，72℃退火20 s，共42個循環；融解條件：65℃、1 min，95℃、15 s，每個標本均做3個復孔。IL-12和IL-17 mRNA的相對表達量用2-ΔΔCT值表示。采用IL-12和IL-17雙抗體夾心法ELISA反應試劑盒（上海源葉生物科技有限公司）；操作過程均按ELISA試劑盒說明書進行，細胞因子的濃度以ng／L表示。

1.4 統計學處理采用SPSS 19.0軟件進行分析。IL-12和IL-17的血清水平及其mRNA相對表達水平以中位數（下四分位數，上四分位數）即M（I，Q）表示，病例組與對照組差異比較使用Mann-Whitney U檢驗，AS患者血清水平和mRNA水平的IL-12和IL-17之間相關性及其與臨床特征的相關性采用Sperman等級相關分析。

2 結果

2.1 研究對象的一般特征病例組年齡為（27.98 ±7.84）歲，對照組年齡為（26.09±7.30）歲，病例組與對照組年齡差異無統計學意義（t＝1.18，P＝0.24）。病例組男／女為15／30，對照組為16／29，病例組與對照組性別比差異無統計學意義（χ2＝0.05，P＝0.82）。在45例AS患者中，93%的患者HLAB27陽性，C反應蛋白（C-reactive protein，CRP）為7.65（2.38，22.00）mg／L，血沉（erythrocyte sedimentation rate，ESR）為14.00（7.00，24.00）mm／h， BASDAI評分為1.73（0.60，2.95）分。45例患者中有2例患者未接受過治療。

2.2 RT-qPCR法檢測RT-qPCR反應結束后確認擴增曲線和溶解曲線，實驗中每個樣本做了3個復孔，反應Ct值落在20～32之間，可以判定此次定量較為準確。反應的溶解曲線均為單峰，表明反應特異性好，無非特異性擴增產物產生，無引物高級結構，定量結果有效。見圖1、2。

表1 IL-12和IL-17血清水平（ng／L）及mRNA相對表達量在各組間的比較［M（I，Q）］

2.3 血清IL-12和IL-17表達水平和PBMCs中IL-12 mRNA和IL-17 mRNA的相對表達及比較血清IL-12水平病例組表達高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）；血清IL-17水平病例組表達亦高于對照組（P＝0.04）；PBMCs中IL-12 mRNA相對表達水平為病例組高于對照組（P＜0.01）；PBMCs中IL-17 mRNA相對水平病例組表達亦高于對照組（P＜0.01）。AS患者活動組與穩定組比較，IL-12和IL-17血清表達水平和mRNA相對水平在兩組間差異均無統計學意義。AS患者中軸型與外周型比較，血清IL-12水平外周型表達高于中軸型（P＝0.02）；血清IL-17水平外周型表達亦高于中軸型（P＜0.01），IL-12 mRNA和IL-17 mRNA相對表達水平在中軸型AS與外周型AS間差異均無統計學意義。見表1。

2.4 相關性分析 AS患者血清IL-12與IL-17水平和PBMCs中IL-12 mRNA與IL-17 mRNA相對水平相關性分析結果見圖3。AS患者血清IL-12水平與IL-17水平呈正相關性（rs＝0.57，P＜0.01）；IL-12 mRNA相對表達與IL-17 mRNA相對表達水平也呈正相關性（rs＝0.35，P＝0.03）。AS患者IL-12和IL-17血清水平和mRNA相對表達水平與AS臨床特點相關性分析結果見表2。AS患者的IL-12和IL-17血清水平或者mRNA相對表達水平與BASDAI、強直性脊柱炎功能指數（bath ankylosing spondylitis functional index，BASFI）、病程、ESR、CRP之間均無相關性。

表2 AS患者IL-12與IL-17血清水平和mRNA相對水平與AS臨床特點相關性分析（r）

3 討論

多種促炎細胞因子和趨化因子在自身免疫性疾病的發病中起重要作用，AS作為一種常見的自身免疫性疾病，這些細胞因子在其發病中的作用值得探討。IL-12與IL-17都是參與多種炎癥反應的促炎細胞因子。IL-12被認為是調節Th1細胞分化的主要細胞因子，可以誘導T細胞向Th1細胞分化，抑制Th2細胞的分化，并促進Th1分泌如干擾素α、腫瘤壞死因子β及IL-2等細胞因子［7］。課題組先前對AS患者血清Th1、Th2相關細胞因子表達水平進行過研究［8］，結果顯示Th1與Th2細胞的平衡在AS患者體內存在著失調，并且顯示IL-12在維持Th1與Th2細胞平衡中起著重要的作用。此外，IL-17對于多種炎性細胞因子表達具有增強作用例如IL-1、IL-6、IL-23等［9］，這表明IL-17在自身免疫性疾病對炎癥反應有加劇的作用。

近年來研究［10］顯示IL-12與多種自身免疫炎癥性疾病的發病有關。在AS研究中比較了60例AS患者和30例健康對照者血清IL-12水平，結果顯示病例組血清IL-12水平顯著高于對照組，提示血清中IL-12濃度的上調與AS的發病密切相關［11］，本研究結果與之一致。IL-17也是一類促炎性細胞因子，在自身免疫病中也備受關注［12］。本研究顯示45例AS患者的血清IL-17水平顯著高于45例健康對照者，先前的研究［13］顯示在類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）患者和AS患者的滑膜液中IL-17表達增加，此外在RA和AS患者的外周血中也顯示Th17細胞和IL-17的表達增加，并且在RA患者中IL-17的表達與關節腫脹數和CRP濃度有密切相關，這種相關在本研究中并沒有發現。本研究結果中外周血IL-12和IL-17的表達水平在AS活動組與穩定組之間差異無統計學意義，并且與BASDAI評分、BASFI評分、ESR、CRP均無相關性，這可能是由于本次研究樣本量較小所致，進一步的研究需要擴大樣本量來探索細胞因子與AS疾病活動之間的關系。

在相關性研究中，AS患者血清IL-12水平與血清IL-17水平呈顯著的正相關性，這與本次研究推論相一致。進一步采用RT-qPCR檢測了病例組和對照組PBMCs中IL-12 mRNA和IL-17 mRNA水平的相對表達水平，結果顯示IL-12與IL-17在mRNA水平呈顯著正相關性。這提示AS患者血清IL-17水平可能隨著IL-12水平的增加而增加。IL-12和IL-17在AS中的相關可能是因為IL-12的水平升高，通過刺激IL-23R+CD4+T細胞，使IL-17大量分泌［5-6］，進而導致大量其他細胞炎癥因子如IL-1、IL-6、IL-23等的分泌增加［9］，促進炎癥反應增強甚至導致AS的發病。

綜上所述，本次研究首次同時檢測了AS患者IL-12和IL-17血清水平和mRNA水平，結果顯示IL-12和IL-17不僅是在血清水平上呈正相關性，并且在mRNA水平上也呈顯著正相關性，提示IL-12和IL-17是相關的細胞因子，并且在AS發病機制中起重要作用。但是血清IL-12和IL-17的表達水平在AS活動組與穩定組之間差異無統計學意義，并且與BASDAI評分、BASFI評分、ESR、CRP無相關性。下一步課題組將考慮進一步擴大樣本量來深入研究IL-12與IL-17與AS疾病活動之間的關系，為AS的早期診斷提供科學依據。

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The expression level of peripheral blood IL-12 and IL-17 and their correlation in patients with ankylosing spondylitis

Zhang Li1，Wang Li2，Li Jianping1，et al
（1Anhui Medical Genetics Center in Anhui Medical College，Hefei 230061；2Dept of Epidemiology and Biostatistics，School of Public Health，Anhui Medical University，Hefei 230032）

ObjectiveTo detect serum IL-12，IL-17 levels and their mRNA levels in AS patients and to explore the role of them in the pathogenesis of AS.MethodsELISA and RT-qPCR were performed to measure the levels of IL-12 and IL-17 in the serum and the mRNA in PBMCs，respectively，of 45 AS patients and 45 healthy controls.ResultsCompared with the controls，AS patients’serum IL-12，IL-17 levels were significantly elevated（P＜0.05）；as the same，AS patient’IL-12 mRNA，IL-17 mRNA levels were significantly elevated compared with the controls（P＜0.05）.Moreover，serum IL-12 level and IL-12 mRNA level both were positive correlated with serum IL-17 level and IL-17 mRNA level，respectively.ConclusionOurResultsindicate that in AS patient’IL-12 and IL-17 are correlated cytokine，and they may play critical roles in the pathogenesis of AS.

IL-12；IL-17；ankylosing spondylitis；serum levels；mRNA levels

R 593.23

A

1000-1492（2015）12-1776-05

時間：2015-11-18 10：12：34

http：／／www.cnki.net／KCMS／detail／34.1065.R.20151118.1012.032.html

2015-10-10接收

國家自然科學基金（編號：81273169，81573218）；安徽高校省級自然科學研究重點項目（編號：KJ2014A127）

1安徽醫學高等專科學校省遺傳醫學中心，合肥 230061

2安徽醫科大學公共衛生學院流行病與衛生統計學系，合肥 230032

3安徽醫科大學第一附屬醫院風濕免疫科，合肥 230022

張 立，女，副研究員；

潘發明，男，教授，博士生導師，責任作者E-mail：famingpan＠ahmu.edu.cn