循環腫瘤細胞檢測及其在前列腺癌中的研究進展

王 娟，楊 柳，馬越云 綜述，郝曉柯審校

（第四軍醫大學西京醫院檢驗科，陜西西安，710032）

近年來，國內外圍繞循環腫瘤細胞（CTCs）在結直腸癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、肺癌等實體腫瘤中的應用價值展開了多項探索性研究。食品藥物監督管理局（FDA）批準了CellSearch檢測的結果可作為轉移性的結腸癌、前列腺癌和乳腺癌 的 預 測 指 標，分 別 以3 個／7.5 微 千、5 個／7.5 微 千 和5個／7.5微千外周血的CTCs為Cutoff值，該值與患者臨床無進展生存期與總生存期相關。CTCs的檢測可有效地應用于體外早期診斷，指導個體化治療包括臨床藥物的篩選、耐藥性的檢測，腫瘤的復發監測以及腫瘤新藥物的開發等，為動態實時監測患者的治療效果提供了最直接的證據。本文就循環腫瘤細胞現今在腫瘤個體化治療領域，特別是在前列腺癌個體化治療中的研究及進展做一回顧和總結。

1 循環腫瘤細胞的檢測方法

如何從成百上億的血細胞中尋找CTCs仍然是現在面臨的問題，此外由于CTCs的易碎性和異質性，也為其分離和檢測帶來一定困難，但CTCs檢測技術在近半個世紀得到飛躍式發展。

1.1 基于生物學特性的CTCs分離檢測技術 利用細胞表面特有的標志物從大量的血細胞中對CTCs進行選擇及純化。負性分選是通過利用白細胞表面的特異性分子抗原，篩除白細胞而留下包括CTCs在內的細胞進一步鑒定。正性分選則是利用上皮細胞黏附分子（EpCAM）進行CTCs選擇。但Ep－CAM 的表達可能在CTCs經歷上皮－間質轉化（EMT）的過程中降低，對EpCAM 低表達的CTCs選擇替代的標志物標記后進行捕獲也成為目前研究的熱點之一［1］。

正性分選的方法最具代表性的CellSearch平臺，可從400多億的血細胞中檢測到單個CTCs，重復性、特異性和敏感性高。CellSearch平臺也有不足：在實際應用中，捕獲的腫瘤細胞由于純度低，利用免疫納米磁顆粒富集時對細胞固定有一定要求，以及CTCs自然降解等原因，對CTCs進行有意義的分子學分析比較困難。另外，由于CTCs的計數結果會由于不同操作者對CTCs的主觀認知不同而不一致，該平臺的技術要求及結果判讀也對操作者的專業知識水平提出了更高的要求。所以需要一整套基于分析CTCs形態學，包括其細胞大小、圓度及細胞凋亡特性等指標的自動化的計數程序，將學者們的認識標準化，以便客觀定量血液中CTCs［2］。基于鈣黏蛋白－11的捕獲技術可用于鑒定低表達EpCAM 的CTCs［3］。

其他基于免疫納米磁顆粒捕獲的系統，如AdnaGen系統利用RT－PCR 的方法分析腫瘤原發灶特異性的基因轉錄本［4］，從而分析CTCs的分子表征。MagSweeper系統以磁性棒為分離基礎的分離器，利用磁性棒運動產生的切變力洗脫血細胞，利用這種方法分離的細胞可以有效保證RNA 的質量以便進一步進行多重定量RT－PCR 及單個CTCs中RNA 測序。VerIFAST 平臺利用兩種不相混的液體的高界面能差，確保只有被納米免疫磁顆粒吸附的細胞能通過不混溶的液體，以快速分離和篩選CTCs［5］。

馬薩諸塞州總醫院（MGH）利用細胞表面抗原的原理研發了一系列的微流控分選設備。第一代μpCTCs 芯片通過78000個涂覆有抗EpCAM 抗體的微電位點捕獲表達EpCAM的CTCs；第二代為HBCTCs芯片通過蝕刻的雙螺旋微流體通道構造增加細胞和涂有抗EpCAM 抗體的通道管壁的接觸時間；第三代CTCs－芯片技術（CTCs－iChip）通過識別腫瘤細胞表面的特異性抗原來實現CTCs的純化。利用負性分選方法富集的CTCs可以進行包括研究單個細胞信號轉導通路在內的各種分子層面包括對CTCs進行分型研究［6］。

另一些基于正性分選的微流控技術如NanoVelcro，設計有包被抗EpCAM 抗體的納米硅金屬導絲與聚二甲基硅氧烷（PDMS）混沌混合器，利用垂直液流的方式增強與CTCs的接觸［7］。GEDI平臺幾何級地增強免疫捕獲差異，通過微電位點上針對特異性抗原的抗體，在芯片上通過監測有效的藥物靶接合實現預測治療反應的目的［8］。

1.2 利用CTCs的其他生物學特性進行富集檢測技術 根據CTCs的其他生物學特性實現對其的分離也是方法之一。這些分離富集方法具有獲取未知的CTCs成分的潛在優勢。例如標記CTCs侵襲和分泌的某些特定蛋白。但這些方法建立在CTCs在體外細胞培養仍存活的基礎上，且這些體外培養條件需要模擬并概括和解釋CTCs的體內生物學行為，所以有一定難度。上皮細胞免疫斑點試驗（EPISPOT）通過對存活CTCs短期內（24～48h）釋放的特異性蛋白質進行檢測，以此明確原發灶相關的CTCs。同樣，基于細胞黏附基質（CAM）為基礎的Vita－Assay平臺，利用腫瘤細胞具有侵襲膠原基質傾向的特性，體外分離存活的CTCs，實現不依賴于EpCAM 的表達來識別的CTCs，并進行CTCs計數和CTCs相關的DNA 分析。這些CTCs的分析方法在幾個轉移性前列腺癌的探索性研究中使用，包括PSMA 免疫細胞化學分析EMT 過程中的標志物研究，陣列比較基因組雜交（CGH）和全基因組的甲基化分析［9］。

1.3 基于物理學特性的CTCs分離檢測技術 可以根據細胞的密度、大小、可變形性及電負荷等特征將CTCs與其他的血細胞之間區分，分離后的細胞根據免疫組化、免疫熒光或PCR進一步鑒定。ISET 平臺通過直徑8μm 的微孔進行血液過濾，之后對保留在過濾器上的細胞進行形態學的染色檢查或免疫細胞化學分析。分別利用CellSearch與ISET 對一批前列腺癌患者外周血的CTCs進行檢測比較，發現兩者只有60%的一致性，提示這兩種細胞的分離技術可以識別CTCs不同的亞群。由于兩個檢測平臺使用不同的指標和標準來定義不同的CTCs，可能出現不一樣的結果：使用ISET 平臺檢測的CTCs最終由病理學家根據形態學標準進行確定，而CellSearch平臺檢測方法對CTCs的最終鑒定則是通過細胞角蛋白的免疫熒光強度和DAPI核染色，可見兩個平臺各有特色：ISET 可以檢測出不表達特異性標志物的CTCs而CellSearch可以收集到直徑小于8μm 的CTCs。

介電泳分離基于不同的細胞存在極化性（即電性能）差異的原理分離CTCs，避免抗體的標記，最低限度修飾CTCs，較好保持細胞活性以便進行后續分子生物學分析［18］。迪安流分餾法（DEF）則是根據細胞體積不同［11］，采用螺旋微通道離心的方法將體積較大的CTCs與血細胞分離，再結合生物學檢測提純獲得CTCs。

1.4 其他創新的CTCs的分離檢測技術 新方法的研發主要集中在如何消除CTCs的生物學和物理學的偏差。可通過RT－PCR技術擴增特異mRNA 進行CTCs檢測，依賴RT－PCR的方法可以特定檢測全血有核細胞群中的前列腺癌細胞的轉錄子［12］。高通量的光纖陣列掃描技術（FAST）可將掃描到的每一個旋涂在顯微鏡載玻片的有核細胞成像［13］。基于激光掃描的CTCs計數結合了與顯微鏡成像與流式細胞技術可最大化檢測CTCs，但需要細胞表達EpCAM 抗體能被觀測到。還可將涂覆有EpCAM 抗體的醫用導線放置到患者的肘靜脈以檢測外周血CTCs，但只能用已知的標志物標記CTCs［14］。

2 CTCs的臨床研究進展

由于CTCs實時反映體內環境的動態變化，可以更準確地反映病情的發展，目前常見的熱點基因檢測幾乎都可以在CTCs上實現。將捕獲的非小細胞肺癌患者外周血CTCs進行EGFR基因突變檢測，發現T790M 的突變與耐藥相關，利用濾過和FA－FISH 技術檢測ALK 基因重排可以預測非小細胞肺癌患者對克唑替尼的療效［15］。對乳腺癌患者CTCs 進行HER－2的表達檢測可以指導赫賽汀的用藥。對轉移性結直腸癌患者的血液標本中分離的CTCs，進行KRAS、PIK3CA 及BRAF的突變情況檢測，可以預測轉移性結直腸癌患者的預后［16］。卵巢癌患者的CTCs中發現ERCC1 表達陽性的患者對鉑類治療效果不佳［17］。同時利用CellSearch和IsoFlux捕獲的CTCs也已經證實可以實現單個CTCs基因分型［18－19］。多重退火和環化循環的擴增技術（MALBAC）成功實現了對于來自癌癥患者外周血單個CTCs 的全基因組擴增和深度測序［20］。該技術使得研究人員可以在單個細胞水平準確探測全基因組拷貝數變異（CNVs）和單核苷酸變異（SNVs）［21］。除了CTCs單細胞測序技術革命，CTCs源性移植瘤模型研究可以保持與原發腫瘤相同的形態學和基因特性，可以穩定傳代，為藥物試驗及耐藥研究提供了良好的平臺［22］。

在前列腺癌的CTCs研究過程中，IMMC－38共招募了276例轉移性前列腺癌患者，對其中的231例進行了有效地評估。該研究利用CellSearch平臺在治療前后按月對患者的外周血CTCs進行持續動態的檢測。研究發現以CTCs 5個／7.5微升外周血為Cutoff值，治療前的CTCs基線水平對患者中位OS具有預測價值，這項臨床研究最終使得FDA 于2008年批準了CellSearch平臺用于轉移性前列腺癌的評估。利用微流體芯片捕獲、RT－PCR 和FISH 技術檢測到前列腺癌患者CTCs中TMPRSS2－ERG 基因融合、雄激素受體AR 突變及AR－V7突變［23－24］，往往提示前列腺癌更具侵襲性及對恩雜魯胺和阿比特龍耐藥。其他CTCs 水平分子特征分析的內容還包括PTEN 缺失、擴增和MYC的擴增，CTCs中Ki－67增殖很大程度上提示前列腺癌患者容易發生去勢抵抗，AR 蛋白的改變與臨床對多西他賽的反應相關，還有對CTCs細胞的微管束研究也發現其與多西他賽化療的療效相關［8］，這些研究都為前列腺癌的個體化治療研究提供了方向和線索，當然這些結果還有待更大樣本量的臨床數據驗證。

CTCs也可用于前列腺癌去勢抵抗的機制研究。AR 信號通路的重新激活是前列腺去勢抵抗的機制之一。FISH 檢測在轉移性前列腺癌CTCs中發現AR 基因的突變、AR 拷貝數量改變［13］。HBCTCs芯片利用單細胞免疫分型動態觀察CTCs到AR 通路的重新激活與前列腺癌耐藥有關。同時，在轉移性前列腺癌患者的CTCs 中也檢測到多種AR 基因突變，如W741R、V757A、R874Y、T877A。

下一代測序技術檢測前列腺癌CTCs的SNVs已經證實與前列腺癌預后相關，而SOD2、GPX1、AR、cyclinB 和bFGF等基因的過表達與轉移相關［25］。通過全外顯子組測序發現CTCs與原發腫瘤組織具有較高的一致性，對一例前列腺癌患者CTCs檢測發現73種突變類型有51種出現在配對組織中吻合率達70%。而腫瘤組織中的56 種突變類型有41 種在CTCs中檢出［26］。這意味著CTCs將為認識前列腺的分子生物學機制提供新視野。

3 小 結

CTCs檢測技術近幾年在CTCs檢測敏感性和全面分析能力有了很大的提高。盡管如此，在不同平臺檢測的靈敏度和結果的驗證由于缺乏統一的標準而受到阻礙，這也使得臨床試驗隊列研究中判斷患者的臨床特征受到影響。因此亟待CTCs檢測技術的標準化及認識規范化。

關于CTCs的分類依賴于細胞分離使用的技術，從細胞形態學標準到對特定的蛋白質標記（上皮和／或間充質），目前仍存在較多的分歧。對比CellSearch和ISET 平臺，在ISET 平臺由病理學家分離鑒定為CTCs的某些細胞不能被CellSearch的抗體所識別。鑒于檢測步驟的各個環節存在太多的不一致，CTCs檢測標準化平臺的建立和臨床驗證在現階段來說是很難實現的。而且標準的制定需要病理學家、生物學家、臨床醫生、生物工程專家等各方各面的專業人士參與。最重要的是國際上首先需要對CTCs的形態學特征和標志物達成共識，之后才是對一些亞型（上皮和／或間充質）的CTCs做出分類。事實上，只有結合生物工程學、臨床醫學和生物學各學科的優勢，才能將CTCs檢測分離技術最終走向成熟，最終有效成為實現腫瘤個體化治療的有力工具。

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