芍藥苷對烏頭堿在Caco-2細胞模型上轉(zhuǎn)運行為的影響研究

鄭 琴 周 歡 熊文海 王 佳 胡鵬翼 楊 明

(江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室，南昌，330004)

芍藥苷對烏頭堿在Caco-2細胞模型上轉(zhuǎn)運行為的影響研究

鄭 琴 周 歡 熊文海 王 佳 胡鵬翼 楊 明

(江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室，南昌，330004)

目的：研究芍藥苷對烏頭堿在Caco-2細胞模型轉(zhuǎn)運行為的影響。方法：以烏頭堿累積轉(zhuǎn)運量及表觀滲透系數(shù)Papp值為指標(biāo)，采用高效液相色譜法對烏頭堿含量進行檢測，考察不同濃度、不同孵育時間、不同方向烏頭堿在Caco-2細胞上的轉(zhuǎn)運行為，以及與芍藥苷不同配伍后轉(zhuǎn)運行為的變化，并考察P-gp抑制劑存在與否對烏頭堿轉(zhuǎn)運行為的影響。結(jié)果：烏頭堿累積轉(zhuǎn)運量與給藥濃度、孵育時間呈正相關(guān)，不同濃度烏頭堿Papp值均大于1×10-6cm·s-1，且保持恒定，無統(tǒng)計學(xué)意義，但外排作用明顯強于吸收，外排比接近1.5。在P-gp抑制劑維拉帕米存在條件下烏頭堿轉(zhuǎn)運量顯著增加。當(dāng)烏頭堿與芍藥苷配伍比例為1∶60時，烏頭堿轉(zhuǎn)運量顯著減小。結(jié)論：烏頭堿為吸收良好的一類藥物，以被動轉(zhuǎn)運為主，但仍存在外排蛋白P-gp的參與。當(dāng)芍藥苷配伍烏頭堿達到一定比例時，對烏頭堿的腸吸收具有顯著的抑制作用。

烏頭堿；Caco-2細胞；芍藥苷；轉(zhuǎn)運；配伍；P-gp抑制劑

附子與白芍配伍最早見于漢代《傷寒雜病論》。附子辛熱，性善行；白芍苦寒，酸收，附子與白芍配伍剛?cè)峄ビ茫魂栆魂帲粺嵋缓皇找簧ⅲ喾聪喑桑删徃阶有辽⒃锪抑_到減毒的作用。附子、白芍配伍具有重要的臨床價值。古人將附子、白芍配伍用于多個臟腑的病證，如脾胃虛寒、中風(fēng)半身不遂、風(fēng)濕骨節(jié)疼痛、血海虛寒、乳癰乳巖、久年陰寒久漏等。當(dāng)代名醫(yī)常將二藥用于寒凝心脈之心痛；寒滯肝脈，絡(luò)道癖阻，脅肋疼痛，肝脾腫大以及痛經(jīng)或痹證寒濕的患者[1]。但是附子毒性較大，應(yīng)用不當(dāng)會產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)，甚至引起死亡。目前已證實，附子的毒性成分主要是雙酯型烏頭類生物堿[2]，其毒性產(chǎn)生快，可能其在胃腸道吸收好有關(guān)[3]。我們考察了白芍主要成分芍藥苷對附子毒性成分烏頭堿在Caco-2細胞模型中轉(zhuǎn)運的影響，以期從腸道吸收角度闡明附子白芍配伍的合理性及配伍減毒機理。

1 材料與儀器

Forma 3111型二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(Thermo electron corporation)，血球計數(shù)板(批號02270113，上海求精生化試劑儀器有限公司)，培養(yǎng)瓶(批號430639，美國costar公司)，F(xiàn)innpipette F1移液器(Fisher Scientific)，1260型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，SZ-93A型自動雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)，3-18K型高速冷凍離心機(德國SIGMA)，3599型96孔板(美國costar公司，)，Elx800酶標(biāo)儀(基因有限公司)，MERS00002跨膜電阻儀(美國millipore公司)，3460型Transwell Permeable Supports(美國costar公司，孔徑0.4 μm，直徑12 mm，底面積1.12 cm2)DMEM高糖培養(yǎng)基(SH30022.01B，美國Hyclone，)，胎牛血清FBS(生化試劑，批號10099-141，美國Gibco公司)，非必須氨基酸NEAA(生化試劑，批號11140-050，美國Gibco公司)，雙抗(生化試劑，貨號P1400-100，Solarbio公司)，0.25%胰酶—0.02% EDTA(批號25200-056，美國Gibco)，HBSS(H1025型，Solarbio公司)，烏頭堿(HPLC﹥98%，成都瑞芬思生物科技有限公司)，芍藥苷(HPLC﹥98%，成都瑞芬思生物科技有限公司)；鹽酸維拉帕米(批號100223-200102，中國藥品生物制品檢定所)；無水乙醇(分析純，批號20130216，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司)，堿性磷酸酶試劑盒(批號20130419，南京建成生物工程研究所)，水為雙蒸水，自制。

Caco-2細胞株購自中國科學(xué)院上海生科院細胞資源中心(來源于美國典型菌種保藏中心ATCC，American Type Culture Collection)，實驗中所用細胞代數(shù)為35～45代。

2 方法

2.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex Gemini C18，250 mm×4.60 mm；流動相：甲醇∶40 mmol/L乙酸銨(氨水調(diào)pH10)=80∶20；流速(F)：1.0 mL/min；檢測波長(λ)：230 nm；柱溫：30 ℃。

2.2 Caco-2單層細胞模型的建立與驗證[4～7]以含10%胎牛血清，1%非必須氨基酸，1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)液。將Caco-2細胞以約1×105個/mL，每孔0.5 mL的密度接種在Transwell內(nèi)培養(yǎng)21 d左右，前1周隔天換液，1周后每天換液。在模型建立的同時對其跨膜電阻值及堿性磷酸酶活性進行監(jiān)測來判斷模型是否達到轉(zhuǎn)運實驗要求。

2.3 MTT法考察給藥濃度范圍內(nèi)的細胞毒性 調(diào)節(jié)細胞胞密度至1×105個/mL，每孔200 μL將細胞懸液移至96孔板內(nèi)各孔(不包括周邊36孔，邊緣效應(yīng)嚴(yán)重)，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，用HBSS清洗細胞一次后加入不同藥液及助溶劑1%無水乙醇，對照組加空白HBSS液，置培養(yǎng)箱中作用3 h，棄去藥液并用HBSS液清洗細胞1次；各孔加入200 μL，0.5 mg/mL的MTT溶液；置培養(yǎng)箱內(nèi)再作用4 h，棄去孔內(nèi)的MTT，加入100 μL DMSO，溶解藍紫色MTT-甲臜結(jié)晶，立即置酶標(biāo)儀中測定在490 nm處的吸光度，每組平行6個孔。

2.4 烏頭堿在Caco-2細胞上轉(zhuǎn)運的研究

2.4.1 烏頭堿藥液的配制 精密稱取置干燥器恒重的烏頭堿對照品11.6 mg于100 mL棕色容量瓶中，加入1 000 μL無水乙醇渦旋至溶解，用HBSS平衡鹽溶液稀釋至刻度制得180 μmol/L的烏頭堿藥液(高濃度)，進一步用HBSS液稀釋分別制得135和90 μmol/L的中濃度和低濃度烏頭堿藥液。

2.4.2 烏頭堿在Caco-2細胞上不同濃度、不同孵育時間的轉(zhuǎn)運 實驗前先用37 ℃的HBSS液清洗各孔3次，最后一次置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)30 min，收集兩側(cè)孵育液。研究吸收時，分別向各孔AP側(cè)加入高、中、低不同濃度藥液0.5 mL，BL側(cè)加入HBSS液1.5 mL，置于37 ℃恒溫搖床中分別于15，30，45，60，90，120 min由BL側(cè)取樣0.5 mL，并在取樣側(cè)補加同溫空白HBSS液0.5 mL。

2.4.3 烏頭堿在Caco-2細胞上不同方向的轉(zhuǎn)運 研究外排時，分別向各孔BL側(cè)加入高、中、低不同濃度藥液1.5 mL，AP側(cè)加HBSS液0.5 mL，置于37 ℃恒溫搖床中分別于15，30，45，60，90，120 min由AP側(cè)取樣0.2 mL，并在取樣側(cè)補加同溫空白HBSS液0.2 mL。

2.5 芍藥苷對烏頭堿在Caco-2細胞上轉(zhuǎn)運行為的影響研究

2.5.1 烏頭堿-芍藥苷配伍混合藥液的配制 精密稱取干燥恒重的芍藥苷對照品約60 mg于10 mL棕色容量瓶中，用180 μmol/L烏頭堿藥液溶解并稀釋至刻度，制得烏頭堿-芍藥苷質(zhì)量比約為1∶60(由附子白芍生藥常用配比1∶1折算)配伍混合藥液。分別精密稱取芍藥苷約20、10、2、1 mg，按同樣的方法分別配制得到1∶20，1∶10，1∶2和1∶1的配伍混合藥液。

2.5.2 與芍藥苷不同比例配伍后烏頭堿轉(zhuǎn)運行為研究 分別向各孔AP側(cè)加不同比例配伍的烏頭堿-芍藥苷混合藥液0.5 mL，BL側(cè)加HBSS液1.5 mL，置于37 ℃恒溫搖床，于120 min由BL側(cè)取樣0.5 mL進行分析。

2.6 鹽酸維拉帕米對烏頭堿在Caco-2細胞上轉(zhuǎn)運的影響研究

2.6.1 烏頭堿-鹽酸維拉帕米溶液的配制 精密稱取干燥恒重的鹽酸維拉帕米適量，用180 μmol/L烏頭堿藥液溶解并稀釋至刻度，制得100 μmol/L鹽酸維拉帕米-180 μmol/L烏頭堿藥液。

2.6.2 鹽酸維拉帕米對烏頭堿轉(zhuǎn)運行為的影響研究 向各孔AP側(cè)加鹽酸維拉帕米和烏頭堿混合藥液0.5 mL，BL側(cè)加HBSS液1.5 mL，置于37 ℃恒溫搖床中于120 min由BL側(cè)取樣0.5 mL進行分析。

2.7 樣品的處理 樣品取出后立即使用高速冷凍離心機23 469×g離心15 min，取上清液，密封后置4 ℃冰箱待分析，24 h內(nèi)檢測完畢。

跨膜電阻=(R樣品-R空白)×膜面積

跨膜電阻即單位面積電阻值，單位為Ω·cm2；R樣品為電阻儀讀數(shù)，單位為Ω；R空白為Transwell內(nèi)未接種細胞只加入新鮮完全培養(yǎng)液的測定電阻值，以實測平均值110Ω計算；膜面積為1.12 cm2。

細胞存活率=A實驗組/A對照組×100%

Papp=(dQ/dt)/(A×C0)，其中Papp單位為cm·s-1,dQ/dt為單位時間藥物轉(zhuǎn)運量(μmol/s),A為Transwell膜面積1.12 cm2，C0為初始藥物濃度(μmol/L)；

由于在每次取樣后都要進行補液，對藥物的濃度產(chǎn)生了稀釋作用，因而對藥物的累積轉(zhuǎn)運濃度TRcum(μmol/L)進行校正：

累積轉(zhuǎn)運量=TRcμm×VR；

其中Cn(μmol/L)為第n個樣品濃度的測定值；Vn(mL)為第n個樣品的取樣體積；VR(mL)為接收側(cè)的體積。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)結(jié)果 烏頭堿保留時間為6.6 min，峰形良好，空白介質(zhì)、助溶劑、芍藥苷及維拉帕米對烏頭堿檢測均無干擾，見圖1；烏頭堿在0.84～214 μmol/L/呈良好的線性關(guān)系，得回歸方程為：Y=0.0 847X-0.2 991，R2=0.9 999；定量下限為0.84 μmol/L；準(zhǔn)確度和精密度良好，高、中、低三個濃度6次測定的RSD值分別為4.34%、2.50%、3.98%；方法回收率為94.70%、85.55%、83.29%；樣品在4 ℃下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

圖1 烏頭堿專屬性實驗

注：A.烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖(溶劑無水乙醇);B.無水乙醇HPLC圖;C.空白介質(zhì)HBSS液HPLC圖;D.空白HBSS液加入烏頭堿對照品溶液HPLC圖;E.空白HBSS液加入烏頭堿及芍藥苷對照品溶液HPLC圖;F.烏頭堿單獨給藥后HPLC圖;G.配伍給藥后HPLC圖

3.2 Caco-2單層細胞模型建立與評價 本實驗條件下，空白電阻值約為110Ω，在細胞接種后的前兩個星期跨膜電阻值隨時間推移穩(wěn)步上升，15 d后趨于穩(wěn)定，穩(wěn)定后的跨膜電阻值大于700Ω·cm2，達到轉(zhuǎn)運實驗要求，見圖2。Caco-2細胞單層培養(yǎng)至1個星期時，AP側(cè)堿性磷酸酶的表達已是BL側(cè)的2倍，且隨培養(yǎng)時間推移堿性磷酸酶的極化更為明顯。

圖2 跨膜電阻值隨培養(yǎng)時間變化±s，n=12)

圖3 不同濃度烏頭堿及溶劑(1%無水乙醇)MTT實驗結(jié)果

注：1～6組分別為208、104、52、26、13和6.5 μmol·L-1烏頭堿；7組為1%無水乙醇；8組為空白對照

圖4 烏頭堿-芍藥苷不同配伍MTT實驗結(jié)果±s，n=6)

注：1～5組分別為烏頭堿與芍藥苷1∶1、1∶2、1∶10、1∶20和1∶60配伍組,，6組為空白對照

3.3 MTT實驗結(jié)果 MTT實驗結(jié)果顯示，助溶劑(1%無水乙醇)及各藥液組細胞存活率均在95%以上，且經(jīng)SPSS 19.0.0軟件采用單因素方差分析，各組結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖3和圖4。說明無水乙醇濃度不高于1%時對細胞活性無顯著影響，可用于增加難溶性雙酯型烏頭類生物堿在HBSS液中的溶解度；烏頭堿在6.5～208 μmol/L濃度范圍內(nèi)，以及烏頭堿與芍藥苷1∶1、1∶2、1∶10、1∶20、1∶60比例配伍各組細胞存活率均在95%以上，各組結(jié)果均無統(tǒng)計學(xué)意義，說明各組配伍比例對Caco-2細胞的活性無顯著影響，即確定可在此范圍內(nèi)進行Caco-2單層細胞模型的轉(zhuǎn)運實驗。

3.4 烏頭堿在Caco-2細胞模型中轉(zhuǎn)運

3.4.1 不同濃度、不同孵育時間、不同方向烏頭堿在Caco-2細胞上的轉(zhuǎn)運 烏頭堿不同濃度、不同時間點，AP-BL和BL-AP側(cè)累積轉(zhuǎn)運量分別見圖5。和圖6，烏頭堿表觀滲透系數(shù)Papp值見表1。結(jié)果顯示，烏頭堿由AP-BL側(cè)轉(zhuǎn)運表觀滲透系數(shù)Papp值大于1×10-6cm/s。高、中、低不同濃度烏頭堿AP-BL側(cè)累積轉(zhuǎn)運量及BL-AP側(cè)累積轉(zhuǎn)運量，在120 min內(nèi)隨著濃度及孵育時間增加而增加；經(jīng)SPSS 19.0.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，在整個濃度范圍內(nèi)，表觀滲透系數(shù)無統(tǒng)計學(xué)意義，但外排與吸收有統(tǒng)計學(xué)意義，外排與吸收比值接近1.5。

圖5 不同濃度、不同時間點烏頭堿AP-BL側(cè)累積轉(zhuǎn)運量隨時間變化情況

圖6 不同濃度、不同時間點烏頭堿BL-AP側(cè)累積轉(zhuǎn)運量隨時間變化情況

濃度(μmol·L-1)AP-BLBL-APPapp(BL-AP)/Papp(AP-BL)18010.20±0.2013.97±0.431.371359.52±0.4414.09±0.761.48909.39±0.2513.90±0.971.48

3.4.2 烏頭堿-芍藥苷不同比例配伍后烏頭堿的轉(zhuǎn)運 烏頭堿與芍藥苷配伍比例為1∶1、1∶2、1∶10、1∶20時，與烏頭堿單獨給藥2 h表觀滲透系數(shù)Papp值無統(tǒng)計學(xué)意義，而1∶60(約等于原藥材1∶1配伍折算)配伍時與烏頭堿單獨給藥2 h的轉(zhuǎn)運量和表觀滲透系數(shù)Papp值有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，配伍后烏頭堿轉(zhuǎn)運量減少，表觀滲透系數(shù)Papp值顯著減小，說明芍藥苷對烏頭堿的吸收具有抑制作用，但是這種抑制作用必須當(dāng)烏頭堿和芍藥苷配伍達到一定比例，配伍前后烏頭堿轉(zhuǎn)運量和表觀滲透系數(shù)見表2和表3。

不同配伍比例烏頭堿(nmol)1∶113.57±0.461∶213.50±0.301∶1013.53±0.411∶2013.31±0.331∶6011.60±0.25*烏頭堿單獨給藥13.61±0.40

注：與烏頭堿單獨給藥比較，*有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，**有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

不同配伍比例烏頭堿(Papp×10-6cm/s)1∶19.35±0.311∶29.30±0.211∶109.32±0.291∶209.17±0.231∶607.99±0.17**烏頭堿單獨給藥9.38±0.27

注：**與烏頭堿單獨給藥組比較，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

3.4.3 鹽酸維拉帕米對烏頭堿在Caco-2細胞上轉(zhuǎn)運的影響 烏頭堿在P-gp蛋白抑制劑存在和或缺條件下在Caco-2單層細胞模型上轉(zhuǎn)運表觀滲透系數(shù)見表4。在120 min內(nèi)，與烏頭堿單獨給藥組相比，烏頭堿+100 μmol/L維拉帕米組中烏頭堿表觀滲透系數(shù)Papp值有顯著增加(P<0.01)。

組別表觀滲透系數(shù)Papp×10-6cm/s烏頭堿10.20±0.20烏頭堿+100μmol/L維拉帕米13.26±0.48**

注：與烏頭堿單獨給藥比較，*有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)**有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

4 討論

目前，運用Caco-2細胞來判斷藥物吸收難易程度是以表觀滲透系數(shù)Papp值為指標(biāo)：Papp﹤10-7cm/s，吸收0～20%，難吸收；10-7cm/s﹤Papp﹤10-6 cm/s，吸收20%～70%，吸收中等；Papp﹥10-6 cm/s，吸收70%～100%，吸收良好[8]。烏頭堿表觀滲透系數(shù)Papp值大于1×10-6cm/s，說明烏頭堿吸收良好，口服生物利用度較高。烏頭堿高、中、低不同濃度烏頭堿AP-BL側(cè)累積轉(zhuǎn)運量及BL-AP側(cè)累積轉(zhuǎn)運量，在120 min內(nèi)隨著濃度及孵育時間增加而增加，在整個濃度范圍內(nèi)，表觀滲透系數(shù)無統(tǒng)計學(xué)意義，外排與吸收有統(tǒng)計學(xué)意義，外排與吸收比值接近1.5。且與維拉帕米合用后表觀滲透系數(shù)Papp值有顯著增加。烏頭堿以被動轉(zhuǎn)運為主，且存在外排蛋白P-gp的參與。

芍藥苷能顯著減小烏頭堿的累積轉(zhuǎn)運量，說明芍藥苷對烏頭堿的腸吸收具有顯著的抑制作用，但是這種作用必須當(dāng)芍藥苷與烏頭堿配伍達到達到一定比例，這也說明中藥配伍比例的重要性。另有文獻報道，芍藥苷也為P-gp蛋白的底物，P-gp蛋白抑制劑能夠增加其腸道吸收[9]。按照理論上推斷，烏頭類生物堿和芍藥苷均為P-gp蛋白的底物，在配伍使用時應(yīng)當(dāng)產(chǎn)生競爭作用，從而產(chǎn)生相互促進吸收的作用。但實驗結(jié)果卻表明，烏頭堿與芍藥苷配伍使用時腸道吸收卻減少。藥動學(xué)研究結(jié)果表明，烏頭堿與芍藥苷配伍后t1/2增加，AUC減少(此部分研究結(jié)果另文發(fā)表)。這些研究結(jié)果提示，芍藥苷對烏頭堿腸吸收的影響是否是通過影響P-gp蛋白而產(chǎn)生的還有待進一步證實。

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(2015-02-02收稿 責(zé)任編輯：洪志強)

Effects of Paeoniflorin on Aconitine Transport Behavior in Caco-2 Cell Model

Zheng Qin, Zhou Huan, Xiong Wenhai, Wang Jia, Hu Pengyi, Yang Ming

(KeyLabofModernPreparationofTraditionalChineseMedicine,MinistryofEducation,JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330004,China)

Objective:To explore effects of Paeoniflorin on Aconitine transport behavior in CacCo-2 cell monolayer model. Methods: Bi-direction transport behaviors of Aconitine and effects of concentrations, incubation time on Aconitine transport behavior were studied on Caco-2 cell. The concentration of Aconitine was analyzed on a reverse-phase HPLC column, Papp value and total transport amount were calculated. The effect of P-gp inhibitor on Aconitine transport behavior was investigated as well. Results: The transport volume of Aconitine was correlated positively with the incubation time and drug concentration. There were no significant differences in the Papp value at the selected concentrations. Bi-directional transport studies on Aconitine showed that the ratio of permeability in the Basolateral to Apical direction is about 1.5 times that of the Apical to Basolateral direction. The Papp value of Aconitine was above 1×10-6cm·s-1. The transport amount of Aconitine was significantly increased in the presence of Verapamil. The transport amount of Aconitine was significantly reduced, when the ratio of Aconitine and Paeoniflorin compatibility was 1∶60. Conclusion:The results suggested that Aconitine could be easily absorbed on the Caco-2 monolayer model by a passive transportation. However, efflux protein may also play an important role in the transport process. When the compatibility of Paeoniflorin and Aconitine reached a certain percentage, intestinal absorption of Aconitine would be reduced remarkably.

Aconitine; Caco-2 Monolayer Model; Paeoniflorin; Transport Behavior; P-gp inhibitor

國家自然科學(xué)基金項目(編號：81060347)；江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目(編號：GJJ08333)

鄭琴(1973—)，女，漢族，江西九江，副教授，博士，E-mail：zhengqin912006@163.com，Tel(Fax)：(0791)87118658；研究方向：中藥新型給藥系統(tǒng)設(shè)計與評價

楊明，教授，博士，Tel(Fax)：(0791)87118658；E-mail：yangming16@126.com

R944

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.03.005