消石利尿化瘀法降低高尿酸血癥大鼠血清尿酸及其機理的研究

王 淳 王林元 鄭 媛 黃銀峰 王麗麗 李艷霞

(1 北京中醫藥大學基礎醫學院,北京,100029; 2 北京中醫藥大學中藥學院,北京,100029)

實驗研究

消石利尿化瘀法降低高尿酸血癥大鼠血清尿酸及其機理的研究

王 淳1王林元2鄭 媛1黃銀峰1王麗麗1李艷霞1

(1 北京中醫藥大學基礎醫學院,北京,100029; 2 北京中醫藥大學中藥學院,北京,100029)

目的:研究以消石利尿化瘀法為指導創制的中藥復方對高血酸血癥大鼠血清尿酸的影響,并對其作用機理進行探討。方法:雄性Wistar大鼠隨機分為空白組、模型組、痛風定膠囊組、苯溴馬隆組及中藥復方組(6.07 g/kg、3.03 g/kg)共6組。除空白組外,其余各組以腺嘌呤和乙胺丁醇灌胃,同時各給藥組灌胃給予相應的藥物;空白組和模型組給予等體積蒸餾水,連續10 d。末次給藥后,取血,分離血清,以紫外分光光度法測定大鼠血清尿酸(UA)、尿素氮(BUN)的含量及黃嘌呤氧化酶(XOD)的活性;用放射免疫分析法測定大鼠血清中尿酸鹽轉運蛋白(UAT)、有機陰離子轉運蛋白(OAT)的含量。結果:中藥復方高、中劑量組大鼠血清UA含量較模型組均降低(P<0.05,P<0.01);中藥復方高劑量組大鼠血清XOD活性與模型組比較,明顯降低(P<0.01);中藥復方中劑量組大鼠血清BUN含量較模型組顯著降低(P<0.05);中藥復方高劑量組大鼠血清UAT含量與模型組比較,明顯升高(P<0.01);中藥復方高、中劑量組大鼠血清OAT含量與模型組比較,均明顯升高(P<0.01)。結論:以消石利尿化瘀法創制的中藥復方能降低高尿酸血癥大鼠血清尿酸含量;其降尿酸機理可能與抑制XOD活性、減少尿酸生成,以及保護腎功能、增加UAT、OAT的含量、促進尿酸分泌與排泄有關。

高尿酸血癥;UA;UAT;OAT;消石利尿化瘀法

高尿酸血癥是痛風發病的生化基礎,屬于難治性疾病。2003年邵繼紅[1]等在南京的調查顯示:高尿酸血癥患病率(男女合計)已達13.3%,與歐美地區2%～18%的水平持平;痛風患病率達1.33%。隨著生活水平的日益提升,飲食結構的逐漸改變,高尿酸血癥和痛風的發病率呈日趨上升趨勢。中醫藥治療痛風有悠久的歷史,積累了豐富的臨床經驗,有一定的優勢。課題組根據前期研究,針對高尿酸血癥屬于濕熱、濁瘀互阻的基本病機特點,針對尿酸鹽結晶屬于結石的客觀事實,結合臨床用藥經驗,確立以消石化瘀利尿法論治高尿酸血癥,擬定中藥復方,前期研究已經證實了其對高尿酸血癥小鼠有降低血清尿酸的作用[2],為進一步確證其作用并探討機制,我們以高尿酸血癥大鼠模型進行研究。

1 材料與方法

1.1 藥物 中藥復方(由金錢草、土茯苓、粉防己、黃柏、萆薢、三七、川牛膝、赤芍、青風藤等組成):北京中醫藥大學基礎醫學院臨床中藥室制備;苯溴馬隆/立加利仙:江蘇昆山龍燈瑞迪制藥有限公司,批號:1010342;痛風定膠囊:成都中匯制藥有限公司,批號:100703。

1.2 試劑 腺嘌呤,北京奧博星生物技術有限責任公司,批號：20101205;鹽酸乙胺丁醇片,杭州民生藥業集團有限公司,批號:T10F541;尿酸試劑盒,南京建成生物工程研究所,批號:20100605;UAT ELISA試劑盒,Adlitteram Diagnostic Laboratorie產品,批號:RT10370;OAT ELISA試劑盒,Adlitteram Diagnostic Laboratorie產品,批號:RT10370。

1.3 動物 清潔級健康雄性Wistar大鼠60只,體重(200±10)g,由中國醫學科學院實驗動物研究所提供,動物合格證號:SCXK(京)2013-0001。

1.4 儀器 TGL-16A臺式高速冷凍離心機,長沙平凡儀器儀表有限公司;SK-1快速混勻器,江蘇國華儀器廠;752紫外光柵分光光度計,上海精密科學儀器有限公司;恒溫水浴鍋,北京長風儀器儀表公司;酶標儀,Thermo MULTISKAN MK3。

1.5 方法

1.5.1 動物分組及給藥方法[3]取雄性Wistar大鼠70只,隨機分為空白組、模型組、苯溴馬隆組(benzbromarone)、痛風定膠囊組(TFD)及中藥復方高、中、低劑量組共7組,每組10只。除空白組外,其余各組以腺嘌呤100 mg/kg及乙胺丁醇250 mg/kg灌胃,連續10 d。同時各給藥組灌胃給予相應的藥物,痛風定膠囊組劑量為0.56 g·kg-1·d-1(相當于成人臨床用量的7倍);苯溴馬隆組劑量為10 mg·kg-1·d-1(相當于成人臨床用量的7倍);中藥復方高、低劑量組劑量按生藥計,分別為6.07 g/kg、3.03 g/kg、1.52 g/kg(分別相當于成人每日用量的14倍、7倍、3.5倍);空白組和模型組給予等體積蒸餾水,連續10 d。

1.5.2 觀察指標 末次給藥后2 h,各組動物水合氯醛麻醉后,腹主動脈取血,分離血清,采用生化法按說明書測定大鼠血清UA、BUN含量及XOD活性;以放射免疫分析法測定血清UAT、OAT含量。

2 結果

實驗結果表明:模型組大鼠血清UA含量較空白組顯著升高(P<0.01);苯溴馬隆組及中藥復方中劑量組大鼠血清UA含量均較模型組顯著降低(P<0.01)。中藥復方高劑量組大鼠血清UA含量較模型組亦降低,差異有統計學意義(P<0.05)。

模型組大鼠血清XOD活性較空白組顯著升高(P<0.01);中藥復方高劑量組大鼠血清XOD活力單位與模型組比較,明顯降低(P<0.01)。但各治療組大鼠血清XOD活力單位與空白組比較,均顯著升高(P<0.01)。

模型組大鼠血清BUN含量較空白組顯著升高(P<0.01);中藥復方中劑量組大鼠血清BUN含量較模型組顯著降低(P<0.05)。其余各治療組大鼠血清BUN含量較模型組亦降低,但沒有統計學意義(P>0.05)。

酶聯免疫測定結果表明:模型組大鼠血清UAT較空白組明顯降低(P<0.01)。苯溴馬隆組及中藥復方高劑量組大鼠血清UAT含量均較模型組顯著升高(P<0.01)。

模型組大鼠血清OAT較空白組大鼠明顯降低(P<0.01)。苯溴馬隆組、痛風定組及中藥復方高、中劑量組大鼠血清OAT含量均較模型組顯著升高(P<0.01)。

表1 中藥復方對高尿酸血癥大鼠模型血清UA、XOD、BUN的影響

注:與空白組比較,*P<0.05;**P<0.01;與模型組比較,ΔP<0.05;ΔΔP<0.01。

表2 中藥復方對高尿酸血癥大鼠模型血清UAT、

注:與空白組比較,*P<0.05;**P<0.01;與模型組比較,ΔP<0.05;ΔΔP<0.01。

3 討論

高尿酸血癥是痛風發生的重要生化基礎。小鼠雌雄個體及同性別個體之間血清尿酸正常值差異較大,作為一種疾病動物模型,個體之間差異過大[4],則實驗結果的準確性會受到影響。因此,本實驗建立高尿酸血癥大鼠模型進行研究,結合臨床發病的實際情況,痛風患者男女比例為20∶1,故實驗中所用動物均為雄性大鼠。

黃嘌呤氧化酶(XOD)能催化黃嘌呤和次黃嘌呤的氧化進而生成尿酸,并產生過氧化物自由基。尿酸濃度過高會導致高尿酸血癥,并可引起痛風的發作。自由基涉及到炎性反應、動脈硬化、癌癥和衰老等病理過程[5]。XOD能明顯促進動脈粥樣硬化斑塊中平滑肌細胞(SMC)的增殖;平滑肌細胞是動脈粥樣硬化(AS)斑塊中的主要細胞,它的增殖在AS形成過程中具有十分重要的意義,而氧自由基可以促進血管平滑肌細胞增殖進而誘發AS[6]。因此,減少體內尿酸和過氧化氫的方法之一是降低人體內XOD的活性。

一個對6 403例患者的調查發現,血清尿酸是腎臟疾病進展的獨立危險因素,其危險性甚至高于蛋白尿[7]。臨床上痛風患者約20%左右有慢性進展的腎臟病變[8],而尸體解剖證實痛風患者有腎臟病變者高達100%[9]。因此,痛風病中出現最早,而且又能危及患者生命的是痛風性腎病[10]。BUN是反映腎臟功能的客觀指標?；加心I臟疾病時,尿酸鹽清除受損,血尿酸鹽水平呈升高傾向。

人尿酸鹽轉運蛋白(hUAT),為電壓敏感性的尿酸轉運蛋白。廣泛表達于各種組織,主要表達于上皮源性細胞,其中在腎臟表達最豐富,為貫穿細胞膜的高度選擇性離子通道[11-12]。hUAT是尿酸由細胞內到細胞外的關鍵轉運體,進入腎近端小管的尿酸鹽50%由其介導分泌到細胞外,排出體外[13]。研究者提出hUAT作為將尿酸鹽分泌至腎近曲小管腔的產電通道,其基因變異可限制細胞內尿酸鹽的外流從而影響腎臟尿酸的分泌,因此可能成為導致疾病的始動的細胞內改變。同時由于hUAT的mRNA在腸道表達較為豐富,腸道中hUAT可能發揮與在腎臟相似的分泌功能[14]。因此認為hUAT在調節全身尿酸鹽的穩態中起重要作用。有機陰離子轉運體(OAT)有2種蛋白,OAT1和OAT3;OAT1主要表達于近曲小管的基底膜,參與對氨基馬尿酸(PAH)轉運,有學者提出在尿酸鹽分泌的第一步,即將尿酸鹽從管周間隙攝取入腎小管細胞這一過程中OAT1起重要作用;OAT1的缺陷會引起血尿酸水平的升高,hOAT1基因突變可能與家族性青年性痛風性腎病(Familial Juvenile Gouty Nephropathy,FJGN)有關[15]。hOAT3基因表達于肝臟、腎臟、腦及眼組織,在近端腎小管的各段均有表達。Erdman等[16]研究發現,hOAT3是一個有機陰離子/二羧酸鹽轉運子,可能參與腎臟尿酸鹽的轉運,但具體作用機制目前還不清楚,因其位于腎小管的基底膜,推測其可能參與管周細胞攝取尿酸鹽,從而有利于尿酸鹽的分泌,或者與基底膜的尿酸鹽排入管周毛細血管及隨后的尿酸鹽重吸收有關。

中醫學認為,高尿酸血癥患者多有先天稟賦異常,或素體脾胃虛弱,或年邁臟腑功能逐漸衰退,若加之飲食不節,沉溺酒酪,嗜啖膏粱厚味,長此以往,致脾失健運、升清降濁無權,水谷不歸正化,濕濁隨之而釀生,留滯臟腑而發病。濕熱濁毒外注皮肉關節可致痛風性關節炎、痛風石的形成;濕熱濁邪久蘊,化熱入血,血中濕熱濁毒稽留,可致痛風性腎病的發生,而發石淋、尿血。總之,濕熱濁毒郁積日久,阻滯絡脈,遂致瘀成,濕熱濁瘀互結,是導致本病發生的根本?；谀蛩徕c鹽的結石屬性,基于90%的高尿酸血癥是由尿酸排泄減少所引起的客觀事實[17],基于瘀濁稽留的基本病機,確立消石利尿化瘀法,消石利尿以促進尿酸鹽的代謝、排泄,活血化瘀以消腫止痛、保護機體,創制中藥復方進行論治。方中金錢草消石化堅散結，清熱利尿,解毒消腫;土茯苓、粉防己、黃柏、萆薢、川牛膝同用以清熱除濕、利尿瀉濁;三七、赤芍相伍有化瘀定痛、活血消腫之功;青風藤通絡止痛、利尿消腫。其中黃柏、牛膝、防己、土茯苓等為治療痛風常用的核心藥物[18]。全方共奏消石化堅散結,利尿除濕瀉濁、化瘀通脈止痛之功。

研究顯示,對于不同方法造成的高尿酸血癥動物模型,以消石利尿化瘀法論治,均能有效降低血清尿酸含量[2],為治療高尿酸血癥提供最基礎的藥效支撐;能降低高尿酸血癥大鼠模型血清的XOD活性,說明消石化瘀利尿法可能通過抑制XOD活性,減少尿酸的生成,達到降低血清尿酸和防治痛風的作用;同時,也可能通過抑制XOD活性而對預防和治療高尿酸血癥的并發癥發揮積極、重要的作用;對高尿酸血癥模型所表現的血清BUN升高有顯著的降低作用,說明消石利尿化瘀法可改善腎臟功能,對預防痛風性腎病有積極意義;還可以通過保護腎臟功能而利于尿酸的排泄,形成良性循環。該方促進尿酸排泄的機制可能與促進UAT、OAT的表達有關。

綜上所述,以消石利尿化瘀法指導組方論治高尿酸血癥,辨證用藥與辨病用藥相結合,傳統中醫理論與現代醫學及藥理研究成果相結合,“消石”可促進尿酸代謝,抑制尿酸鹽結晶;“利尿”促進尿酸排泄;“化瘀通脈”可消散瘀濁、保護機體;標本兼治。既有理論依據,又取得了實驗研究所奠定的藥效基礎,可對臨床論治高尿酸血癥提供借鑒。

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(2014-11-25收稿 責任編輯：王明)

Research on the Effect and Mechanism of “Expelling Stone, Diuresis and Removing Stasis” Method on Reducing UA in Serum of Hyperuricemia Rats

Wang Chun1, Wang Linyuan2, Zheng Yuan1,Huang Yinfeng1, Wang Lili1, Li Yanxia1

(1SchoolofBasicMedicalsciencesBUCM,Beijing100029,China;2SchoolofChineseMateriaMedicaBUCM,Beijing100029,China)

Objective:To investigate the effect and mechanism of Chinese herbal compounds prescription, which based on the traditional therapeutics of “expelling stone, diuresis and removing stasis”, on uric acid (UA) in rats with hyperuricemia. Methods: Male Wistar rats were randomly divided into normal group, model group, Tongfengding Capsules group, Benzbromarone group and Chinese herbal compounds prescription group(TFK) in two doses of 6.07 g·kg-1and 3.03 g·kg-1. In addition to the normal group, the rest were offered with Ademine and the Ethambutol for 10 days. While the appropriate drugs administered to the rats of the administration group, the normal group and the model group were given by gavage distilled water for 10 days. Then blood was collected, UA, BUN content and XOD activity in serum were determined by ultraviolet-visible spectroscopy while UAT、OAT content in serum were detected by radiommunoassay. Results: Compared with the model group, the concentration of UA in high-dose and middle-dose Chinese herbal compounds prescription group significantly decreased in serum(P<0.05,P<0.01). The level of XOD activity of high-dose group significantly decreased as compared to the model group (P<0.01). The BUN content of middle-dose group was decreased in serum compared to the model group (P<0.05). The UAT content of high-dose group compared to the model group was significantly increased (P<0.01). The content of OAT in high-dose and middle-dose group was significantly increased in serum compared to the model group (P<0.01). Conclusion: The Chinese herbal compounds prescription which based on the traditional therapeutics of “expelling stone, diuresis and remove stasis” decreased the uric acid content in hyperuricemia model rats. The mechanism may be related to the relieving effect of the activation of XOD, reducing generation of uric acid, protecting renal function, increasing of UAT and OAT content and promoting excretion of uric acid.

Hyperuricemia; UA; UAT; OAT; Expelling stone; Diuresis and removing stasis

國家自然科學基金面上項目(81273632)——基于P38-NF-κB-MCP-1路徑的消石利尿化瘀法保護高尿酸血癥大鼠血管內皮功能的研究,負責人:王淳

王林元,副教授,主要研究方向:中藥產業化應用;王淳,副教授,主要研究方向:中醫藥防治痛風，E-mail:wangyl@bucm.edu.cn

R259;R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.03.022