優化治療神經膠質瘤復方抗瘤丸的實驗研究

馮英楠 陳 菲 張 鵬 莊 偉 林曉蘭 王秀娟

(1 首都醫科大學中醫藥學院,北京,100069; 2 首都醫科大學宣武醫院,北京,100053)

優化治療神經膠質瘤復方抗瘤丸的實驗研究

馮英楠1陳 菲2張 鵬2莊 偉2林曉蘭2王秀娟1

(1 首都醫科大學中醫藥學院,北京,100069; 2 首都醫科大學宣武醫院,北京,100053)

目的:通過實驗研究,優化治療神經膠質瘤中藥復方抗瘤丸(KLW)的組成,得出最佳處方配伍。方法:采用大鼠神經膠質瘤C6細胞BALB/c裸鼠移植瘤模型,將模型裸鼠按瘤塊體積隨機分為10組(模型組,陽性藥對照組(替莫唑胺TMZ組),KLW-1、KLW-2、KLW-3、KLW-4高、低劑量組,每組7只裸鼠。)連續給藥15 d,檢測各組裸鼠體重、瘤塊體積、瘤塊重量、微血管密度(MVD)、血管內皮生長因子(VEGF)、凋亡細胞、Bcl-2,Bax蛋白表達水平。結果:與模型組比較,KLW-1高、低劑量組,KLW-2、KLW-4高劑量組,TMZ組瘤體積顯著減小(P<0.05);KLW-4高劑量組,TMZ組移植瘤的MVD值明顯降低(P<0.05);KLW-2、KLW-4高劑量組,TMZ組移植瘤VEGF灰度值明顯增高(P<0.05);KLW-1、KLW-2、KLW-4高劑量組,TMZ組細胞凋亡率顯著增高(P<0.05);各給藥組Bcl-2/Bax的比例增加。結論:處方KLW-1高、低劑量組,KLW-2、KLW-4高劑量組對C6移植瘤的生長具有較好的抑制作用。

抗瘤丸;神經膠質瘤;處方優化

膠質瘤是中樞神經系統最常見的一類腫瘤,約占腦腫瘤32.8%～54.9%。這類腫瘤治療困難,生存期短,死亡率高,對人類健康威脅極大。流行病學顯示,目前我國神經膠質瘤患者約為20余萬,每年新發病例3萬余例。手術、放療和化療仍然是不同版本腦膠質瘤治療指南所堅持的總原則[1-2],但治療效果往往差強人意。中藥復方抗瘤丸(KLW)因其較好的安全性和一定的有效性在該腫瘤的治療中發揮了積極作用。KLW是由白花蛇舌草、半枝蓮、白英等18味中藥組成的中藥復方院內制劑,主要功效為利濕解毒,扶正培本,活血化瘀。用于膠質瘤之濕熱藴毒證,臨床以頭痛、眩暈、視物不清,或兼嘔吐,舌紫暗或有瘀斑,脈沉或沉細等為特征,適用于腦膠質瘤、腦垂體瘤等見上述表現者的輔助治療。臨床應用近30年,服用的患者累計10萬余人次。回顧性研究表明,KLW可抑制膠質瘤細胞的增殖,延長惡性膠質瘤患者的生存時間,具有肯定療效[3],且價格低廉,有較好的開發價值和前景。本研究旨在前期體外細胞實驗的基礎上,運用中醫學理論作指導進行處方篩選,為臨床應用和處方優化提供依據。

1 實驗材料與方法

1.1 藥物 復方制劑抗瘤丸1、2、3、4組(KLW-1、KLW-2、KLW-3、KLW-4)由首都醫科大學宣武醫院藥劑科提供,替莫唑胺(批號:H20080313),購于美國先靈葆雅制藥公司。

1.2 動物 BALB/c裸小鼠購于北京維通利華實驗動物技術有限公司,實驗動物生產許可證號:SCXK(京)2012-0001。

1.3 儀器 6500型CO2培養箱(美國NAPCO),TE2101L型電子天平(德國賽多利斯),電子數顯卡尺(中國廣陸),倒置顯微鏡(日本OLYMPUS),DM3000顯微鏡(德國Leica)。

1.4 試劑 CD34抗體,兔抗人原始造血細胞單克隆抗體(北京中衫金橋生物技術有限公司,批號:12620110);VEGF抗體,rabbit IgG(武漢博士德生物工程有限公司,批號:10CM199);二抗,(H+L)/HRP辣根酶標記山羊抗兔(北京中衫金橋生物技術有限公司,批號:K126816A);TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司,批號:12469600);Bcl-2抗體,rabbit IgG,(26kDa,北京中衫金橋生物技術有限公司,批號:B1312),Bax抗體,rabbit IgG,(21kDa,武漢博士德生物工程有限公司,批號:BA0315),二抗,辣根酶標記山羊抗兔(北京中衫金橋生物技術有限公司,批號:101964)。

1.5 方法

1.5.1 處方篩選 復方制劑KLW-1,是18味中藥組成的原方院內制劑。君臣藥味基本不變,根據中醫藥理論及臨床實踐經驗,按照功效、配伍意義將佐使藥分為清熱解毒、活血化瘀、化痰散結3組,同類藥進行篩減,得到3個待選處方。分別形成由9味藥組成的KLW-2方、由10味藥組成的KLW-3方和由12味藥物組成的KLW-4方。

1.5.2 模型制備 培養足夠量的C6細胞以建立裸鼠體內移植模型。取對數生長期的C6細胞,0.25%胰酶消化后,PBS漂洗2遍,離心,用無血清的DMEM培養基重懸細胞。裸鼠接種時體重范圍為19.0～22.8 g,周齡為6～8周,將細胞懸液注射至裸鼠右側腋窩,0.2 mL/只,保證5×106個細胞一次性注射至裸鼠右側腋窩。

1.5.3 分組、給藥 待裸鼠體內瘤塊長到300～1 000 mm3時按瘤塊大小分組,使每組動物的瘤塊大小平均值接近。分組后立刻按25 mL·kg-1灌胃給予受試藥物,模型組給予同體積的去離子水。每天1次,連續給藥15 d后處死裸鼠。KLW-1、KLW-2、KLW-3、KLW-4高、低2個劑量組(3.4 g生藥·kg-1、0.85 g生藥·kg-1)。陽性對照藥(替莫唑胺膠囊)43 mg·kg-1。

1.5.4 指標檢測 給藥結束后處死裸鼠,取各組裸鼠的瘤塊,稱重。給藥第0、3、6、9、12、15 d測量動物體重、腫瘤的最大直徑(L)和最小直徑(D),按如下公式:V=1/2×L×D2計算各組腫瘤體積V的大小;CD34免疫組化法染色,Weidner法計數微血管密度;VEGF免疫組化法染色,圖像分析測定灰度值;TUNEL法檢測凋亡細胞,計算腫瘤細胞凋亡率;Western blot檢測Bcl-2,Bax蛋白表達。

2 實驗結果

2.1 給藥期間對裸鼠體重的影響 整個給藥期間,各組動物體重均增長,各組裸鼠體重之間沒有顯著性差異。僅在給藥第3 d,KLW-2低劑量組,KLW-4低劑量組和KLW-4高劑量組體重均顯著高于模型對照組,(均P<0.05),表1。

2.2 給藥期間對腫瘤體積的影響 給藥3 d后,所有處方組移植瘤的體積均顯著減少(P<0.05);給藥6 d后,KLW-1高、低劑量組移植瘤的體積顯著減少(P<0.05);給藥9 d后,KLW-2高劑量組移植瘤的體積顯著減少(P<0.05);給藥12 d后,KLW-1低劑量組,KLW-2、KLW-4高劑量組移植瘤的體積顯著減少(P<0.05);給藥15 d后,KLW-1、KLW-2高、低劑量組,KLW-4高劑量組,陽性藥對照組移植瘤的體積顯著減少(P<0.05),表2。

2.3 給藥15 d后各組裸鼠瘤重量比較 與模型對照組比較,KLW-1低、高劑量組,KLW-2高劑量組,KLW-4高劑量組,陽性藥對照組移植瘤的重量顯著降低(P<0.05),表3。

2.4 給藥15 d后各組裸鼠腫瘤微血管密度(MVD)比較 倍鏡下腫瘤的新生微血管染成棕黃色,與模型對照組比較,KLW-4高劑量組,陽性藥對照組移植瘤的MVD值明顯降低(P<0.05),表4、圖1。

表1 抗瘤丸給藥15 d對BALB/c雄性裸鼠體重的影響

注:與模型對照組比較，*P<0.05。

表2 抗瘤丸給藥15 d對BALB/c雄性裸鼠腫瘤體積的影響

注:與模型對照組比較，*P<0.05。

表3 給藥15 d各組裸鼠瘤重量比較

注:與模型對照組比較,*P<0.05。

表4 給藥15 d各組腫瘤微血管密度比較

注:與模型對照組比較，*P<0.05。

圖1 免疫組化CD34在C6移植瘤中的表達(DAB,×200)

注:1為模型組,2為陽性對照組,3為KLW-4高劑量組,4為KLW-2高劑量組,5為KLW-1高劑量組,6為KLW-1低劑量組。

2.5 給藥15 d后各組裸鼠腫瘤組織中VEGF表達的差異 與模型對照組比較,KLW-4高劑量組,KLW-2高劑量組,陽性藥對照組移植瘤VEGF陽性反應的灰度值明顯增高(P<0.05),表5、圖2。

2.6 給藥15 d后各組裸鼠腫瘤細胞凋亡率的差異 模型對照組可見少量呈棕褐色的凋亡細胞,而KLW-4高劑量組,KLW-2高劑量組,KLW-1高劑量組,陽性藥對照組可見大量的凋亡細胞,凋亡細胞核被染成棕褐色,表現為細胞核固縮,胞體縮小變形、破裂成小碎片或出現凋亡小體。與模型對照組比較,上述給藥組細胞凋亡率顯著增高(P<0.05),表6、圖3。

表5 給藥15 d各組腫瘤VEGF灰度值比較

注:與模型對照組比較，*P<0.05。

圖2 免疫組化VEGF在C6移植瘤中的表達(DAB,×200)

注:1為模型組,2為陽性對照組,3為KLW-4高劑量組,4為KLW-2高劑量組,5為KLW-1高劑量組,6為KLW-1低劑量組。

表6 給藥15 d各組腫瘤細胞凋亡率比較

注:與模型對照組比較，*P<0.05。

2.7 給藥15 d后各組裸鼠瘤腫瘤細胞凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax表達的差異 Westernblot結果顯示,模型對照組能明顯下調Bax蛋白的表達,而KLW-1高、低劑量組,KLW-2高劑量組,KLW-4高劑量組和陽性藥對照組,都能明顯上調Bax的表達,模型組和各給藥組的Bcl-2蛋白均呈低表達,圖4。

3 討論

流行病學調查顯示,我國人群腦膠質瘤占全部腦腫瘤的44.6%。值得注意的是,近30年原發性惡性腦腫瘤發生率逐年遞增,年增長率約為1.2%,老年人尤為明顯。膠質瘤化療領域最值得注意的當屬新型烷化劑替莫唑胺[4],2009年成為NCCN指南推薦的治療腦膠質瘤的一線用藥。然而,替莫唑胺作為細胞毒類藥物,具有骨髓抑制、消化道反應等,血小板減少和中性粒細胞減少的不良反應,很多患者因不能耐受而退出治療。更為重要的是,就我國國情而言,替莫唑胺非常昂貴。與西藥相比,中醫藥在治療膠質瘤過程中注重辨證論治,整體調節。中醫認為腦瘤屬髓海病變,其成因多由痰濕之邪結聚于腦,腦部氣滯血瘀,痰瘀阻滯,毒邪凝結所致。在其病變過程中痰瘀互結,腦絡痹阻日久,化熱動風,風火相煽,耗傷陰液,可致肝腎不足[5]。醫院制劑KLW臨床證明該藥瘤體有效控制率達68.0%,可明顯改善頭疼頭暈、惡心嘔吐等癥狀[3]。除個別患者在服藥初有腹部飽滿不適以外,未出現血尿便常規異常,亦未見肝腎損傷,安全可靠,同時價格低廉,僅為替莫唑胺的1/30～1/50。

圖3 TUNEL染色顯示C6移植瘤中的凋亡細胞(呈棕褐色)(DAB,×200)

注:1為模型組,2為陽性對照組,3為KLW-4高劑量組,4為KLW-2高劑量組,5為KLW-1高劑量組,6為KLW-1低劑量組。

圖4 Bax，Bcl-2在C6移植瘤中的表達

注:1為模型組,2為KLW-1低劑量組,3為KLW-4高劑量組,4為KLW-2高劑量組,5為KLW-1高劑量組,6為陽性對照組。

本實驗結果顯示,給藥3 d后,抗瘤丸所有處方組對C6細胞移植瘤的生長具有明顯的抑制作用,導致裸鼠移植瘤生長緩慢,可見中藥復方KLW各處方組對膠質瘤的抑制作用起效快;給藥第6 d后,KLW-1高、低劑量組對C6細胞移植瘤的生長具有明顯的抑制作用，KLW-1治療膠質瘤作用優勢明顯,低劑量即可抑制腫瘤生長;給藥9 d后，KLW-2高劑量、給藥15 d后,KLW-1低、高劑量組,KLW-2低、高劑量組,KLW-4高劑量組,陽性藥對照組對膠質瘤生長有一定的抑制作用,移植瘤的體積明顯小于模型對照組。

腫瘤發生的病理機制十分復雜,迄今為止尚未發現哪些因素可直接導致膠質瘤,根據分子病因學顯示,其發生和發展與多種因素有關[6-8]，包括原癌基因活化、抑癌基因失活、凋亡相關基因異常、血管活性因子高表達、相關信號轉導通路的激活等。與治療靶點單一的西藥化療藥相比,多靶點、多途徑、多環節發揮抗瘤效應是中藥的顯著特點。目前研究認為,中草藥及其活性成分抗膠質瘤的藥理機制涉及多個方面[9]。包括影響膠質瘤細胞周期;抑癌相關基因的表達;調節機體免疫功能;抑制腫瘤血管生長;誘導腫瘤細胞分化;調節腫瘤細胞信號傳導;抑制端粒酶活性和細胞毒作用等。

大量研究結果證實：實體腫瘤的生長和代謝需要持續的血管生長，腫瘤血管生成與腫瘤的生長、浸潤、轉移、分期及預后有密切關系。腫瘤微血管密度(MVD)是衡量腫瘤血管形成程度的標志,MVD檢測有多個血管內皮標志物可以選擇,其中CD34特異性強。目前研究認為血管的發生過程對于腫瘤的生長和轉移起著重要作用，由于VEGF這種血管內皮細胞特異性生長因子在血管發生中起著重要的調節作用，在腫瘤組織內、外都可以大量分泌VEGF。Bax蛋白是一種促凋亡蛋白,而Bcl-2蛋白是一種抗凋亡蛋白,可抑制Bax蛋白的功能,通常Bcl-2/Bax蛋白的相對比例決定細胞的凋亡率,Bcl-2/Bax的比例增加,促進細胞的凋亡。

抗瘤丸是由18味中藥組成的復方制劑,其主要抗瘤成分包括白花蛇舌草、半枝蓮、白英,這些中藥成分已有大量的藥理學實驗證明了其抗瘤機制。其中白花蛇舌草可改變腫瘤細胞周期分布,誘導細胞凋亡[10],誘導腫瘤細胞促凋亡基因的表達[11]。半枝蓮可明顯抑制bcl-2基因高表達[12-13],調節腫瘤VEGF[13]。白英可調節腫瘤細胞caspase基因表達,從而起到抗癌作用[14]。實驗結果顯示,KLW-4能夠抑制血管內皮生長因子VEGF的表達,阻抑C6裸鼠移植瘤的血管內皮細胞增殖,降低微血管密度,從而產生抗腫瘤組織新生血管形成作用。同時,通過上調促凋亡蛋白Bax的表達,下調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達來促進腫瘤細胞凋亡。KLW-1和KLW-2不能通過抑制VEGF表達而產生抗腫瘤血管形成作用,主要通過促進Bax表達,促進腫瘤細胞凋亡。

綜上所述,KLW-1高、低劑量組,KLW-2高劑量組,KLW-4高劑量組,可抑制膠質瘤生長,對膠質瘤治療有一定作用效果。下一步將建立人源裸鼠膠質瘤模型,與陽性對照藥替莫唑胺比較,觀察KLW-1,KLW-2,KLW-4抑制膠質瘤效果,進一步篩選處方,為臨床應用提供依據。

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(2014-12-01收稿 責任編輯：王明)

Study on Optimization of KLW for Treating Glioma

Feng Yingnan1, Chen Fei2, Zhang Peng2, Zhuang Wei2, Lin Xiaolan2,Wang Xiujuan1

(1SchoolofTraditionalChineseMedicine,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069，China；2XuanwuHospitalofCapitalMedicalUniversity,Beijing100053，China)

Objective:To optimize compound KLW, and screen for the best prescription. Methods: C6 cells in BALB/c nude mice transplantation tumor model was established, and then randomly divided into ten groups (the model control group, the TMZ group, and low, high dose KLW-1, KLW-2, KLW-3, KLW-4 group, each group including seven rats). The rats were orally administered with medication for 15days. The study measured weight of mice, the transplanted tumor volume and weight, MVD, VEGF, apoptotic cells, the Bcl - 2, Bax protein expression level. Results: Compared with model control group, low, high dose KLW-1, high dose KLW-2 and KLW-4 TMZ group of tumor volume significantly reduced(P<0.05); high dose KLW-4, TMZ group of tumor MVD decreased (P<0.05); high dose KLW-2 and KLW-4， TMZ group of tumor VEGF value increased (P<0.05); high dose KLW-1,KLW-2 and KLW-4, TMZ group of cell apoptosis rate increased (P<0.05); each dose group the Bcl - 2 / Bax ratio increases. Conclusion: Low and high dose of KLW-1and KLW-2, high dose KLW-4 have good effects on the growth of C6 transplantation tumor inhibition.

KLW; Glioma; Prescription optimization

北京市中醫藥科技項目(編號:JJ2010-12);衛生局215人才-領軍人才(編號:303-01-005-0063);市科委-基地培育與發展工程專項(編號:303-01-004-0004-02);首都醫科大學基礎臨床課題(編號:13JL71)

馮英楠(1988—),女,碩士,從事中藥藥效與作用機制研究,Tel:(010)83911624;E-mail:fengyingnan88@163.com

王秀娟,教授,博士生導師,從事中藥藥效與作用機制及中藥資源可持續利用研究,Tel:(010)83911624;E-mail:wxj0517@sina.com;林曉蘭,主任藥師,從事中藥制劑研發與醫院藥學管理,Tel:(010)83198684;E-mail:xllin83@163.com

R285.5;R273

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.03.026