祛濕化瘀方通過調(diào)節(jié)AMPK活性改善高脂飲食誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性脂肪肝肝臟脂肪代謝

馮 琴 孟勝喜 唐亞軍 李曉飛 彭景華 趙 瑜 胡義揚(yáng)

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海中醫(yī)藥大學(xué)肝病研究所，上海高校中醫(yī)內(nèi)科學(xué)E-研究院，教育部肝腎疾病病證實(shí)驗(yàn)室，上海市中醫(yī)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海，201203)

祛濕化瘀方通過調(diào)節(jié)AMPK活性改善高脂飲食誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性脂肪肝肝臟脂肪代謝

馮 琴 孟勝喜 唐亞軍 李曉飛 彭景華 趙 瑜 胡義揚(yáng)

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海中醫(yī)藥大學(xué)肝病研究所，上海高校中醫(yī)內(nèi)科學(xué)E-研究院，教育部肝腎疾病病證實(shí)驗(yàn)室，上海市中醫(yī)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海，201203)

目的：研究祛濕化瘀方對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠脂肪肝AMPK蛋白活性及其相關(guān)脂肪代謝靶蛋白活性的影響，以探討該方防治實(shí)驗(yàn)性脂肪肝的作用機(jī)制。方法：采用高脂飼料飲食誘導(dǎo)大鼠脂肪肝模型，造模大鼠給予高脂飲食4周后，按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為模型組及祛濕化瘀方組，分別灌胃給予飲用水及中藥祛濕化瘀方4周。實(shí)驗(yàn)8周末取材后觀察：1)肝組織三酰甘油(Triglyceride，TG)、游離脂肪酸(Free Fatty Acid，F(xiàn)FA)含量，2)肝組織病理變化(HE染色、油紅染色)，3)肝組織腺苷酸活化的蛋白激酶(AMP-Activated K inase，AMPK)及磷酸化AMPK、肝組織總蛋白及核蛋白固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(Sterol Regulatory Element Binding Protein-1c、SREBP-1c)、肝組織總蛋白及核蛋白碳水化合物反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(Carbohydrate Response Element Binding Protein、ChREBP)含量、肝組織乙酰輔酶A羧化酶(Acety1 CoA Carboxylase，ACCase)及磷酸化ACC蛋白含量，4)肝組織AMPKα1、AMPKα2、SREBP-1、ACCα、SREBP-1c及ChREBP基因表達(dá)水平。結(jié)果：1)模型組肝組織TG、FFA含量顯著升高，肝組織出現(xiàn)明顯大泡樣脂肪變性；模型組肝組織AMPK蛋白磷酸化水平降低、核蛋白SREBP-1與ChREBP表達(dá)增加、ACC蛋白磷酸化水平降低蛋白活性升高。2)祛濕化瘀方組肝組織TG、FFA含量較模型組顯著降低，肝組織炎癥及脂肪變性程度減輕；祛濕化瘀方能顯著升高肝組織AMPK、ACC蛋白磷酸化水平、降低核蛋白SREBP-1及ChREBP含量。結(jié)論：祛濕化瘀方通過調(diào)節(jié)AMPK活性及其相關(guān)靶蛋白活性改善高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠脂肪肝肝脂肪代謝，這可能是該方有效防治實(shí)驗(yàn)性脂肪肝的重要作用機(jī)制之一。

實(shí)驗(yàn)性脂肪肝；腺苷酸活化蛋白激酶；祛濕化瘀方；肝脂肪代謝

肝臟脂肪代謝功能障礙，肝細(xì)胞內(nèi)三酰甘油(Triglyceride，TG)含量過度升高是非酒精性脂肪肝(Nonalcoholic Fatty Liver,NAFL)最基本的病理改變[1]。前期研究反復(fù)證實(shí)了祛濕化瘀方對(duì)實(shí)驗(yàn)性NAFL大鼠肝組織三酰甘油和FFA降低效應(yīng)顯著[2-4]。單磷酸腺苷(AMP)激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)作為一類重要的蛋白激酶，在NAFLD的發(fā)病過程中起重要作用。AMPK由于廣泛介導(dǎo)了機(jī)體主要糖脂代謝組織的調(diào)控過程，成了目前代謝性疾病的研究熱點(diǎn)，也是目前研究治療NAFLD藥物作用靶點(diǎn)之一[5]。本研究圍繞AMPK活性及受其調(diào)節(jié)的與脂肪代謝相關(guān)靶蛋白活性，運(yùn)用高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠脂肪肝體內(nèi)模型探討祛濕化瘀方降低NAFL肝脂肪含量改善脂質(zhì)代謝的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD雄性大鼠30只，體重(170±20)g，清潔級(jí)，購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK(滬)2003-0002。上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心清潔級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)、造模與觀察，自由飲水。

1.2 主要試劑 TG試劑盒，浙江東歐生物工程公司，Lot No.2009.11.0003；游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)試劑盒，南京建成生物有限公司，Lot No.20100409；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，Lot No.P0012；RNA抽提試劑盒，Lot No.2608A，購自上海華舜生物工程有限公司；核蛋白提取試劑盒(Cytoplasmic and Nuclear Protein Extraction Kit),Fermentas產(chǎn)品，Lot：00069231；多克隆AMPKα抗體、多克隆p-AMPKα(Thr172)、p-ACC(Ser79)抗體及多克隆ACC抗體均為Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品；多克隆SREBP-1抗體、多克隆CHREBP抗體為Abcam公司產(chǎn)品；單克隆α-Tublin抗體為EPITMICS公司產(chǎn)品。多克隆Lamin B抗體為Santa Cruze公司產(chǎn)品；RNA抽提試劑盒，Cat No.W6701，Lot No.2608A，購自上海華舜生物工程有限公司；cDNA合成試劑盒，Lot No.1310，F(xiàn)ermentas公司產(chǎn)品；熒光定量PCR試劑盒，Lot No.BK4402，TAKARA公司產(chǎn)品；PCR引物由TAKARA公司設(shè)計(jì)、上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列及片段長度如下(表1)。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物 祛濕化瘀方組成:茵陳15 g、虎杖12 g、田基黃12 g、姜黃9 g、生梔子9 g，均購自上海華宇藥業(yè)有限公司。梔子、田基黃水提醇沉，茵陳、姜黃、虎杖醇提，配成0.93 g生藥/mL濃度用以灌胃給藥。

1.4 模型制備方法 大鼠飼以高脂飼料(88%普通飼料+2%膽固醇+10%豬油)8周。飼料購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.5 動(dòng)物分組和給藥 SD雄性大鼠30只，按計(jì)算機(jī)隨機(jī)數(shù)字表分為正常組10只、造模組20只，造模大鼠給予高脂飼料造模四周后，隨機(jī)分為模型組、祛濕化瘀方治療組各10只。繼續(xù)給予高脂飼料造模同時(shí)，治療組灌服祛濕化瘀方藥液(0.93 g生藥/100 g鼠重)，模型組給予相應(yīng)量的生理鹽水灌胃，共給藥4周。

2 結(jié)果

2.1 祛濕化瘀方對(duì)NAFL模型大鼠肝臟脂肪含量的影響 與正常組相比，模型組大鼠肝組織TG、FFA含量均顯著升高(P<0.01，P<0.01)，祛濕化瘀方有很顯著的降低組織TG、FFA的作用(P<0.01，P<0.05)，祛濕化瘀方組肝組織TG、FFA含量分別為模型組的53.4%、65.9%。(見表2)。

表2 各組大鼠肝組織脂肪含量±s)

注：*P<0.05，**P<0.01，vs模型組。

2.2 祛濕化瘀方對(duì)NAFL模型大鼠肝組織病理的影響 HE染色顯示：模型組大鼠均出現(xiàn)不同程度的脂肪變性及空泡樣變，變性的肝細(xì)胞極度腫脹呈圓形，體積較正常明顯增大，胞漿內(nèi)充滿大量脂肪空泡，部分細(xì)胞可見細(xì)胞核擠向胞膜。肝小葉內(nèi)可見多處的點(diǎn)狀壞死灶，壞死區(qū)及少量匯管區(qū)有炎細(xì)胞浸潤。祛濕化瘀方組大鼠脂肪變性程度及細(xì)胞腫脹明顯減輕，胞內(nèi)脂滴數(shù)量相對(duì)減少，炎性細(xì)胞浸潤及壞死灶較模型組減少。油紅O染色顯示與正常大鼠相比模型大鼠肝細(xì)胞明顯腫大、變圓，胞內(nèi)呈現(xiàn)深淺不等的油紅著色，中央靜脈周圍的肝細(xì)胞油紅染色較深。祛濕化瘀方組肝細(xì)胞腫大程度與胞內(nèi)脂肪油紅著色程度都比模型組相對(duì)淺。(圖略)

依據(jù)非酒精性脂肪性肝病診療指南[6]，組織病理學(xué)診斷將肝細(xì)胞脂肪變性分為4度(F0-4)：F0，<5%肝細(xì)胞脂肪變；F1，5%～30%肝細(xì)胞脂肪變；F2，30%～50%肝細(xì)胞脂肪變性；F3，50%～75%肝細(xì)胞脂肪變；F4，75%以上肝細(xì)胞脂肪變。Ridit分析結(jié)果顯示：模型組脂肪變性程度較正常組顯著升高(P<0.01)，祛濕化瘀方組脂肪變性程度較模型組顯著降低(P<0.05)(見表3)。

表3 各組肝組織病理HE染色脂肪變性比較

注：*P<0.05，**P<0.01，vs正常組；△P<0.05，vs模型組。

圖1 各組AMPK、p-AMPK、ACCα 及p-ACCα蛋白表達(dá)情況

注：(A)WB圖片，(B)WB圖片條帶灰度積分半定量柱狀圖；ND，HFD，HFD+QHD分別為正常組、模型組及祛濕化瘀方組；*P<0.05，**P<0.01，vs正常組；##P<0.01，vs模型組。

2.3 祛濕化瘀方對(duì)NAFL大鼠肝組織AMPK及磷酸化AMPK蛋白含量、總蛋白及核蛋白SREBP-1、CHREBP含量、以及肝組織ACC及磷酸化ACC蛋白含量的影響 與正常組相比模型大鼠肝組織AMPK含量稍有下降，祛濕化瘀方干預(yù)后沒有顯著變化，但肝臟AMPK活性形式p-AMPK含量模型組較正常組顯著降低，祛濕化瘀方組能顯著升高p-AMPK含量，提高AMPK蛋白活性。

模型組大鼠肝組織ACCα蛋白含量與正常組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但祛濕化瘀方干預(yù)后，高脂飲食模型大鼠肝組織ACCα蛋白含量顯著降低。模型組ACCα蛋白Ser79磷酸化水平顯著低于正常組，祛濕化瘀方干預(yù)能顯著提高模型大鼠ACCα蛋白磷酸化水平。

與正常組相比，模型組肝組織總蛋白中SREBP-1蛋白含量顯著升高，祛濕化瘀方組與模型組相比沒有太大變化。對(duì)于能體現(xiàn)蛋白活性的核蛋白SREBP-1蛋白含量模型組顯著高于正常組，且祛濕化瘀方有顯著的降低效應(yīng)。

模型組大鼠肝組織總蛋白CHREBP含量與正常組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但祛濕化瘀方干預(yù)后，高脂飲食模型大鼠肝組織總蛋白CHREBP含量顯著降低。對(duì)于具有蛋白活性功能的核蛋白CHREBP含量，模型組顯著高于正常組，且祛濕化瘀方治療組顯著低于模型組。

圖2 各組肝組織總蛋白及核蛋白 SREBP-1、CHREBP表達(dá)情況

注：(A)WB圖片，(B)WB圖片條帶灰度積分半定量柱狀圖；ND，HFD，HFD+QHD分別為正常組、模型組及祛濕化瘀方組；*P<0.05，**P<0.01，vs正常組；##P<0.01，vs模型組。

2.4 祛濕化瘀方對(duì)NAFL大鼠肝組織AMPKα1、AMPKα2、SREBP-1、ACCα、SREBP-1c及CHREBP基因表達(dá)的影響 模型大鼠AMPKα1基因表達(dá)較正常組顯著降低，模型大鼠AMPKα2基因表達(dá)與正常組相比雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，有較大幅度降低，祛濕化瘀方與模型組相比AMPKα1、AMPKα2均有降低趨勢(shì)。模型組肝組織SREBP-1基因表達(dá)量顯著高于正常組，祛濕化瘀方組與模型組相比有降低趨勢(shì)。正常組、模型組與祛濕化瘀方組肝組織CHREBP/ACCα基因表達(dá)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(見表4)。

表4 各組肝臟AMPKα1、AMPKα2、SREBP-1、CHREBP

注：*P<0.05，vs正常組。

3 討論

“祛濕化瘀方”由茵陳、梔子等5味中藥組成，是臨床治療NAFLD的有效中藥復(fù)方[7]。近10年十余次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)反復(fù)證實(shí)了該方顯著降低實(shí)驗(yàn)性NAFL大鼠肝臟脂肪含量、減輕肝臟炎癥的藥理效應(yīng)，其降低肝組織TG和FFA降低效應(yīng)尤為顯著[2-4]。

AMPK在肝臟脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。AMP激活的AMPK作為一類重要的蛋白激酶與肥胖及代謝綜合征相關(guān)疾病的發(fā)病密切相關(guān)[4],成為近年來研究的熱點(diǎn)。AMPK系統(tǒng)是細(xì)胞能量的感受器。當(dāng)代謝應(yīng)激時(shí)，ATP生成減少(例如葡萄糖和氧缺乏)而消耗增加(例如肌肉收縮)，細(xì)胞內(nèi)AMP：ATP的比值升高，AMPK即被激活。一旦被激活，AMPK打開產(chǎn)生ATP的分解代謝通路而關(guān)閉消耗ATP的過程，例如生物合成，細(xì)胞生長及增值。AMPK復(fù)合物由α催化亞單位和β、γ調(diào)節(jié)亞單位構(gòu)成，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其中α亞單位的蘇氨酸172位點(diǎn)及其磷酸化對(duì)AMPK活性的調(diào)節(jié)起重要作用，一旦172位蘇氨酸磷酸化，AMPK被激活為有活性的p-AMPK形式，則可通過調(diào)節(jié)下游蛋白激酶或調(diào)控各種基因表達(dá)從而影響機(jī)體的能量代謝。AMPK在細(xì)胞能量平衡中的作用主要是通過對(duì)代謝酶的快速直接的修飾(磷酸化)實(shí)現(xiàn)的。

多項(xiàng)研究表明，無論在先天瘦素基因缺乏的ob/ob小鼠還是高糖或高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD動(dòng)物模型中均存在AMPK磷酸水平及活性的降低，AMPK基因及蛋白活性的改變?cè)贜AFLD的發(fā)病過程中起重要作用[8-9]。乙酰輔酶A羧化酶(Acetyl-CoA Carboxylase，ACC)和3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，HMG-CoA)是最早發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)AMPK的靶蛋白，其分別是脂肪酸和膽固醇合成過程中的關(guān)鍵酶。ACC是丙二酸單酰輔酶A合成過程中的限速酶，而丙二酸單酰輔酶A既是脂肪酸合成的前體，又可抑制肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1的活性從而干擾長鏈脂酰輔酶A進(jìn)入線粒體，最終抑制線粒體脂肪酸氧化。因此，AMPK通過磷酸化ACC抑制其活性，降低肝細(xì)胞中丙二酸單酰輔酶A的含量，從而抑制脂肪酸的合成并增強(qiáng)線粒體對(duì)脂肪酸的利用和氧化[4]。

SREBP-1C是調(diào)節(jié)糖脂代謝的重要轉(zhuǎn)錄因子，它直接參與調(diào)控有關(guān)脂質(zhì)合成相關(guān)酶基因如ACC、FAS、SCD的表達(dá)，增加肝臟脂質(zhì)合成[10]。ChREBP是一在糖脂代謝過程中發(fā)揮重要作用的轉(zhuǎn)錄因子[10]，ChREBP的靶基因主要是參與糖酵解和脂質(zhì)合成的一些酶類，因而ChREBP的激活可促進(jìn)葡萄糖向脂質(zhì)轉(zhuǎn)化。AMPK可以減少再攝食誘導(dǎo)SREBP-1c和ChREBP的轉(zhuǎn)錄激活。此外，AMPK還能夠磷酸化ChREBP Ser568位點(diǎn)，使其與DNA的結(jié)合能力下降，從而抑制葡萄糖反應(yīng)性基因的轉(zhuǎn)錄[11]。

鑒于AMPK蛋白活性及其調(diào)節(jié)的脂肪代謝相關(guān)靶蛋白活性改變?cè)贜AFL的發(fā)病過程中的重要作用，祛濕化瘀方顯著降低實(shí)驗(yàn)性脂肪肝肝臟脂肪含量有效防治NALF是否與調(diào)節(jié)該蛋白活性相關(guān)呢？本研究運(yùn)用高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠脂肪肝模型觀察祛濕化瘀方對(duì)AMPK蛋白活性及其相關(guān)脂肪代謝靶蛋白SREBP-1、CHREBP、ACC活性的影響，以探討該方有效防治實(shí)驗(yàn)性脂肪肝的作用機(jī)制。

研究結(jié)果證實(shí)在高脂飲食誘導(dǎo)的NAFL模型中存在AMPK基因與蛋白磷酸化水平的下降、核蛋白SREBP-1及CHREBP表達(dá)的升高及ACC蛋白磷酸化水平的下降，揭示了AMPK及其調(diào)控的脂肪代謝通路與該模型肝臟脂肪過度沉積的之間的關(guān)系。同時(shí)，研究結(jié)果也顯示祛濕化瘀方干預(yù)后模型大鼠AMPK、ACC磷酸化水平顯著升高、核蛋白SREBP-1及CHREBP含量顯著降低，提示該復(fù)方對(duì)該模型AMPK活性及其相關(guān)的靶蛋白有良性調(diào)節(jié)作用。這可能是該方改善肝臟脂肪代謝、有效防治NAFLD的重要機(jī)制之一。

[1]Dyson JK，Anstee QM，McPherson S.Non-alcoholic fatty liver disease：a practical approach to treatment[J].Frontline Gastroenterol，2014,5(4):277-286.

[2]張慧,馮琴,胡義揚(yáng),等.祛濕化瘀方對(duì)CCl4復(fù)合高脂低蛋白飲食誘導(dǎo)的大鼠脂肪肝的防治作用[J].上海中醫(yī)藥雜志,2006，40(3):52-55.

[3]馮琴,張慧,胡義揚(yáng),等.祛濕化瘀方對(duì)單純高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠脂肪肝的防治作用[J].中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2006，16(1):26-29.

[4]李紅山,馮琴,胡義揚(yáng),等.祛濕化瘀方對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠肝臟脂質(zhì)沉積的干預(yù)效應(yīng)[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2009,29(12):1096-1099.[5]Hasenour CM，Berglund ED，Wasserman DH.Emerging role of AMP-activated protein kinase in endocrine control of metabolism in the liver[J].Mol Cell Endocrinol，2013,366(2):152-162.

[6]中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組.非酒精性脂肪性肝病診療指南(2010年修訂版)[S].中華肝臟病雜志,2010,18(3):163-166.

[7]慕永平,都金星,劉平.劉平教授治療非酒精性脂肪性肝炎遣方用藥經(jīng)驗(yàn)探析[J].中西醫(yī)結(jié)合肝病,2009,19(3):170-171.

[8]Minokoshi Y，Kim Y B，Peroni O D，et a1.Leptin stimulates fatty acid oxidation by activating AMP activated protein kinase[J].Nature,2002,415(6869):339-343.

[9]丁曉潔,王佑民,王麗萍.高脂飲食對(duì)大鼠肝臟組織AMPK表達(dá)及其活性的影響[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009,44(6):680-683.

[10]Xu X，So JS，Park JG，et a1.Transcriptional control of hepatic lipid metabolism by SREBP and ChREBP[J].Semin Liver Dis，2013，33(4):301-311.

[11]Jeffrey D.Browning1 and Jay D.Horton.Molecular mediators of hepatic steatosis and liver injury[J].The Journal of Clinical Investigation，2004,114(2):147.

(2014-12-26收稿 責(zé)任編輯：洪志強(qiáng))

Qushi Huayu Decoction Inhibits Hepatic Lipid Accumulation by Activating AMP-Activated Protein Kinase in Experimental Fatty Liver of Rats

Feng Qin， Meng Shengxi， Tang Yajun， Li Xiaofei， Peng Jinghua， Zhao Yu,Hu Yiyang

(InstituteofLiverDiseases,ShuguangHospitalAffiliatedtoShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicinet,Shanghai201203,China)

Objective: The present study was conducted to investigate whether Qushi Huayu Decoction (QHD) could inhibit hepatic lipid accumulation by activating AMP-activated protein kinase (AMPK) in experimental fatty liver of rats. Methods: Nonalcoholic fatty liver (NAFL) model was duplicated with high-fat diet in rats. Results: QHD significantly decreased the accumulation of fatty droplets in livers, lowered triglyceride (TG) and free fatty acid (FFA). Moreover, QHD supplementation reversed the HFD-induced decrease in the phosphorylation levels of AMPK and acetyl-CoA carboxylase (ACC) and decreased hepatic nuclear protein expression of sterol regulatory element-binding protein-1 (SREBP-1) and carbohydrate-responsive element-binding protein (ChREBP) in the liver. Conclusion: QHD has significant effect on inhibiting hepatic lipid accumulation via AMPK pathway in vivo.

Experimental fatty liver; AMP-activated protein kinase (AMPK); Qushi Huayu Decoction; Hepatic lipid metabolism

國家自然基金面上項(xiàng)目(編號(hào)：81374031，81173404)；上海市自然基金項(xiàng)目(編號(hào)：13ZR1442600)

R256.49

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.02.002