基于方證相關探討茵陳蒿湯調控庫普弗細胞功能及MAPK通路抗肝纖維化的作用機制

曹紅燕 邊艷琴 武 超 李建緣 劉 平，3 孫明瑜，3

(1 上海中醫藥大學曙光醫院，上海中醫藥大學肝病研究所，上海，201203； 2 上海中醫藥大學肝腎疾病病證教育部重點實驗室，上海，201203； 3 上海高校中醫內科學E-研究院，上海，201203)

基于方證相關探討茵陳蒿湯調控庫普弗細胞功能及MAPK通路抗肝纖維化的作用機制

曹紅燕1，2邊艷琴1武 超1，2李建緣1，2劉 平1，2，3孫明瑜1，2，3

(1 上海中醫藥大學曙光醫院，上海中醫藥大學肝病研究所，上海，201203； 2 上海中醫藥大學肝腎疾病病證教育部重點實驗室，上海，201203； 3 上海高校中醫內科學E-研究院，上海，201203)

目的：基于前期茵陳蒿湯類方抗肝硬化的方證病理基礎結果，圍繞“方-證相關”的學術內涵，提出了“方證相關時，方劑對機體基因的調控遵循‘無差錯修復’原則”的假說；并探討茵陳蒿湯對DMN誘導大鼠肝纖維化形成階段肝組織庫普弗細胞(Kupffer Cells，KCs)相關基因表達及對絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的影響。方法：采用wistar大鼠，于每周前3天連續腹腔注射0.5%二甲基亞硝胺(Dimethylnitrosamine，DMN)制備大鼠肝纖維化模型，2周末取模型組6只做動態觀察。第3周初開始，在持續造模的同時給予茵陳蒿湯干預治療到4周末，正常組與模型對照組給予等量生理鹽水。4周末在3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉情況下，殺鼠取材，檢測肝功能、肝組織病理、肝組織羥脯氨酸含量、膠原半定量，并采用基因芯片檢測分析茵陳蒿湯對模型大鼠肝組織基因表達譜的影響。結果：與正常組比較，造模4周大鼠血清肝功能水平明顯升高(P<0.01)；病理觀察肝組織炎細胞顯著浸潤，膠原顯著沉積(P<0.01),肝組織白介素1(IL-1b)、Cd68、腫瘤壞死因子受體超家族成員14(Tnfrsf14)、腫瘤壞死因子受體超家族成員9(Tnfrsf9)、TNF受體超家族成員6(Fas)、Cd14、結締組織生長因子(Ctgf)、Ⅰ型膠原α2(Col1a2)、胰島素樣生長因子結合蛋白(Igfals)、胰島素樣生長因子1(Igf1)、胰島素樣生長因子結合蛋白1(Igfbp1)、基質金屬蛋白酶12(Mmp12)、基質金屬蛋白酶2(Mmp2)、基質金屬蛋白酶23(Mmp23)、趨化因子配體21(Ccl21)、蛋白激酶Cβ(Prkcb)基因表達明顯上調，MAPK通路被激活。經2周治療后茵陳蒿湯能顯著降低DMN誘導的大鼠血清肝功能水平，抑制組織炎細胞的浸潤與壞死，膠原沉積，并下調了肝組織IL-1b、Cd68、Tnfrsf14、Tnfrsf9、Fas、Cd14、Ctgf、Col1a2、Igfals、Igf1、Igfbp1、Mmp12、Mmp2、Mmp23、Ccl21、Prkcb基因的表達，抑制了MAPK通路的活化。通過全基因芯片的分析，在茵陳蒿湯干預治療后基因表達得到了不同程度的修復。結論：驗證了“方證相關時,方劑對機體基因的調控遵循‘無差錯修復’原則”的假說；茵陳蒿湯顯著抑制DMN誘導肝纖維化形成，其機制可能是調控了KCs，抑制相關炎癥因子的釋放，同時可能參與調控MAPK通路，從而達到抗肝纖維化的作用。

中醫方證相關；茵陳蒿湯；肝纖維化；無差錯修復原則;基因分析

“方證相關”是指一個方劑內的藥味及其配伍關系與其針對的病證病機或病理環節之間具有高度相關性或反應性。“方證相關”強調了方藥與其作用對象——病證之間的相互作用，即方劑的功用是特定方藥與其作用對象特定病證之間相互作用的結果[1]。方證相關與“系統生物學”注重研究組分之間的相互作用的理念不謀而合，即強調方藥與其作用對象——病證之間的相互作用，也就是說方劑的功效是方藥作用于特定病證而顯示出的，表現為方劑功效對證具有依賴性或選擇性，只有方證相關時，才能顯現出應有的療效，而一旦離開其所相對應的病證，可能就收效甚微甚至失去治療作用。

茵陳蒿湯由茵陳蒿、梔子和大黃組成，首載于《傷寒論》，為臨床上治療濕熱內蘊型肝膽疾病的首選方劑。《傷寒論》中從主治病證、制方思想等方面考察各方,分析其與茵陳蒿湯之間的相似性，確定入選茵陳蒿湯類方的方劑：茵陳蒿湯、梔子柏皮湯、茵陳五苓散。梔子柏皮湯由梔子、黃柏和甘草組成，也具有清熱利濕的功效，是治療黃疸之熱重于濕證的代表方劑。茵陳五苓散由茵陳蒿和五苓散(具有利水滲濕，溫陽化氣的功效)組成，具有利濕清熱的作用，是治療黃疸之濕重于熱證的代表方劑。課題組前期在中醫藥理論指導下，采用茵陳蒿湯及其類方(梔子柏皮湯、茵陳五苓散、甘露消毒丹等)，以溫陽利濕的茵陳四逆湯作為對照，以二甲基亞硝胺(DMN)、四氯化碳(CCl4)和膽管結扎等大、小鼠慢性肝損傷、肝纖維化模型，采用分子生物學、中藥化學、藥理學和計算生物學等多學科交叉綜合手段，分別從不同層次、不同水平研究茵陳蒿湯類方的(經)方-證(候)-效(應)關系；研究結果表明茵陳蒿、梔子柏皮湯和茵陳蒿五苓散可以顯著抑制DMN誘導的大鼠肝纖維化、肝硬化模型[2-7]，而且茵陳蒿湯顯著修復了DMN模型的DNA損傷，而對CCl4誘導的肝硬化模型，卻不顯效，甚至出負向調節，加重損傷[6]。

如果假定動物疾病模型存在中醫“證”的內涵，根據“方證相關”理論，這種相關性的高低是根據方劑所體現出的治療效果所判定的，即治療效果越好，那么方與證的相關程度越高，反之則相關程度越低。DMN誘導的大鼠肝纖維化模型存在濕(瘀)熱內蘊證，且濕(瘀)熱皆重，與茵陳蒿湯方證相關度最高，所以茵陳蒿湯有效[2-6]。偏于清熱或者偏于利濕的梔子柏皮湯和茵陳五苓散僅能改善個別指標，都很難獲全效[5]。而茵陳四逆湯不但不能改善任何指標，而且還加重了DMN誘導的大鼠肝臟的炎癥和肝纖維化[7]。

基于前期“茵陳蒿湯類方抗肝硬化的方證病理基礎研究”結果，我們圍繞“方-證相關”的學術內涵，提出了“方證相關時,方劑對機體基因的調控遵循‘無差錯修復’原則”的假說。

肝纖維化是指肝臟內彌漫性細胞外基質(特別是膠原物質)過度沉積，是機體對各種病因引起的慢性肝損傷后的一種損傷修復反應[8]，是肝硬化的早期可逆階段。持續性損傷因子的過度刺激，使肝臟中瘢痕組織大量沉積，影響正常肝組織的超微結構并最終導致肝硬化。纖維形成過程包括致病因素、效應細胞、信號及進行信號調節的分子，最終導致細胞外基質(ECM)大量沉積。肝細胞死亡或受損是肝纖維化鏈式反應的開始，它可由細胞毒素、病毒感染直接引起，或肝細胞代謝障礙所至，也可由激活的免疫系統間接引起。KCs是肝臟內重要的非實質細胞，雖僅占肝臟體積的2%，卻承擔著機體單核吞噬細胞系統功能的80%～90%，在維持機體內環境恒定上起重要作用[9]。KCs不但分泌致炎因子，而且能夠直接分泌膠原，在肝纖維化的發生發展中發揮重要作用，而且在肝纖維化的逆轉過程中，也發揮了重要的作用[10]。

本實驗通過DMN誘導的肝纖維化大鼠模型，采用具有清熱利濕作用的茵陳蒿湯干預治療，通過觀察動物的整體狀況、肝功能、病理組織學、肝組織羥脯氨酸含量，綜合判斷茵陳蒿湯的治療效果。通過對模型組及用藥組的全基因芯片的分析，驗證方證相關時,方劑對機體基因的調控遵循‘無差錯修復’原則的假說；尋找KCs分泌相關的差異基因，并通過通路查找KCs分泌的相關因子與MAPK通路的相互關系，構建相關網絡圖，旨在進一步探討KCs活化后與MAPK通路的關系及其肝纖維化進程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 Wistar雄性大鼠，體重(150±10)g，清潔級，購自中國科學院上海實驗動物中心，動物合格證編號：2007000537089，生產許可證號：SCXK(滬)2007-0005。上海中醫藥大學實驗動物中心清潔區動物房飼養、造模和觀察，自由飲食，動物房使用許可證號：SYXK(滬)2009-0069。

1.1.2 藥物 所用藥物均按《中華人民共和國藥典》2000年版中的規定，采用道地藥材，生藥學專家鑒定，保存樣品備查。統一由上海中醫藥大學附屬曙光醫院國家中醫藥管理局中藥制劑中心(國家中醫藥管理局三級實驗室)一次制備后冷凍保存。方中藥物劑量均為65 kg體重成人的1 d用量。茵陳蒿湯方由茵陳蒿18 g、梔子10 g、大黃6 g組成。將梔子(1 kg)與大黃(0.6 kg)制成粗粉末，與茵陳蒿(1.8 kg)一起水煎兩次，藥汁濃縮成浸膏，真空干燥后冷藏保存。生藥總重量為3.4 kg，真空干燥后重量為0.565 kg，每克含生藥6.018 g。

1.1.3 試劑 DMN，購自日本東京化成株式會社(批號:MAL05)，TRIS,北京鼎國昌盛生物科技有限責任公司，批號：1BQ100150；氯化鈉注射液，上海長征富民金山制藥有限公司，批號：12050603；羥脯氨酸(Hydroxyproline，HYP)標準品，日本ナカティテスク株式會社，批號：MIR8282；高氯酸，分析純，上海金鹿化工有限公司，批號：F20110809。Alpha-Actin(Smooth Muscel),Rabbit Monoclonal Antibody,購買自Epitomics公司，貨號：5264-1；蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒，上海威奧生物科技有限公司，產品編號：WH1144。鹽酸，分析純，批號：20100426；檸檬酸三鈉，分析純，批號：F20101021；一水合檸檬酸，分析純，批號：F20101102；無水乙酸鈉，分析純，批號：F20090908；無水乙醇，分析純，批號：20120410；乙醇(95%)，分析純，批號：20101019；二甲苯，分析純，批號：20120208；30%過氧化氫，分析純，批號：20120105；異丙醇，分析純，批號：20120528；4-(二甲氨基)苯甲醛(P-Dimethylaminobenzal)，批號：F20110929；氯氨-T(Chloramines-T)，批號：T20101116；羥甲基纖維素鈉,批號：F20080523；吐溫80，批號：F20110726；均購自國藥集團化學試劑有限公司。血清丙氨酸氨基轉移酶(Alanine Aminot Ransfer Ase,ALT)測定試劑盒，貨號C009-2；血清天冬氨酸氨基轉移酶(Aspartate Aminot Ransfer Ase，AST)測定試劑盒，貨號C0010-2；血清白蛋白(Albumin,ALB)測定試劑盒，貨號A028-1；血清總膽紅素(Total Bilirubin，TBil)測定試劑盒，貨號C018,均購自南京建成生物工程研究所。T RIzo l、雜交試劑盒、體外轉錄的標記試劑盒、單循環cDNA合成試劑盒、生物素化抗體、鏈霉素和藻紅蛋白等試劑及基因芯片掃描儀3000、基因芯片洗滌工作站(Affymetrix Fluidics Station 450)、Affymet rix基因芯片雜交爐640、GeneChipó操作軟件1.2等儀器、軟件均由上海生物芯片公司提供。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 參照Ala-Kokko方法造模[11]。模型組大鼠以2 mL/kg劑量于每周前3d連續腹腔注射0.5%的DMN溶液(以0.9%氯化鈉溶液稀釋)，共4周。正常對照組大鼠腹腔注射等量的0.9%氯化鈉溶液。

1.2.2 分組給藥 大鼠按體質量分層隨機的方法分為正常組(10只)、模型組(12只)、茵陳蒿湯組(10只)。模型組與各給藥組均予以DMN造模。從造模第3周開始，各中藥干預組于繼續造模的同時按成人(70 kg)體質量日用量的8倍，即每天茵陳蒿湯0.967 g/kg(相當于生藥3.886 g/kg)，臨用前用蒸餾水稀釋，以10 mL/kg大鼠體質量的劑量灌胃給藥，每日1次，共2周；正常組與模型組以同體積0.9%氯化鈉溶液灌胃。

1.2.3 樣品的采集與處理 在實驗4周末，大鼠用3%戊巴比妥鈉以2 mL/kg體質量劑量腹腔注射麻醉后，仰臥位固定，打開腹腔，觀察肝脾的色、質、形態等情況。經下腔靜脈采血，摘取肝脾，稱重后，從肝臟最厚一葉切取1.0 cm×1.0 cm大小肝組織2塊，10%中性福爾馬林固定，其余肝組織裝管于-70 ℃保存備用。選取一套標本脫水、包埋、切片，HE及天狼猩紅染色，觀察組織病理學變化。所采血液4 ℃靜置3 h后，3 000 r/min離心15 min，分離血清，-70 ℃保存備用。

1.2.4 觀察項目與方法

1.2.4.1 一般情況 包括大鼠的體重、肝重、脾重、腹水及死亡情況，并計算肝體比、脾體比等。

1.2.4.2 肝組織病理 肝組織蘇木精-伊紅染色(HE)及天狼猩紅染色觀察肝臟組織學變化。膠原纖維增生程度分期標準如下。0期：正常肝臟，無明顯膠原纖維增生；Ⅰ期：膠原纖維增生，中央靜脈和門脈區有少量星狀膠原纖維束放散，但無間隔形成；Ⅱ期：膠原纖維增生，中央靜脈和門脈區結締組織變厚，由此向四周伸出纖維索，形成不完全間隔；Ⅲ期：膠原纖維大量增生，有個別菲薄的完全間隔形成，或較厚的不完全間隔即將形成假小葉；Ⅳ期：膠原纖維大量增生，完全纖維間隔較厚，假小葉大量形成。

1.2.4.3 肝功能檢測 谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)、白蛋白(Alb)和總膽紅素(Tbil)含量均按照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書測定。

1.2.4.4 肝組織Hyp含量測定 參照Jamall方法[12]測定肝組織Hyp含量。

1.2.4.5 肝組織基因芯片雜交實驗 提取各組肝臟總核糖核酸(RNA)，純化，合成互補脫氧核糖核酸(cDNA)，純化，生物素標記互補核糖核酸(cRNA)，片斷化cRNA，雜交，洗脫、染色、掃描芯片。基因芯片：Afymetrix Rat 2302.0基因表達譜芯片，共載基因探針31099個。RNA的抽提采用T RIzol試劑盒。用純化的RNA合成雙鏈cDNA，生物素標記的cRNA的合成參考BioArrayTM HighYieldTM RNA轉錄標記試劑盒方法。將cRNA片段雜交于Afymetrix Rat 2302.0芯片。基因芯片的數據處理:首先將信號進行標準化和基于模型的表達指數(Mode-l Based Expression Index,MBEI)分析，得出校正后的數值，用于差異基因分析。特征性基因表達譜分析采用聚類分析法。特征性基因的篩選采用Fold change法，兩個芯片的每個基因之間倍數通過表達指數比值得出，以識別特征性基因，并用MBEI的標準誤差來計算倍數的可信區間，本研究在組間進行比較時，以倍數的可信下限作為基因表達上調或下調的評判標準。

1.2.4.6 統計學方法 采用SPSS 15.0統計軟件。計量資料以ANOVA程序進行單因素方差分析、q檢驗，并用LSD進行兩兩比較，等級資料采用Ridit分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 各組大鼠體重、肝重、脾重、肝體比、脾體比及腹水發生率情況見圖1。各組均無大鼠死亡。與正常組比較，模型組肝體比值顯著降低(P<0.01)，提示大鼠肝臟在纖維化形成過程中明顯縮小；與模型組比較，茵陳蒿湯組肝體比值明顯升高(P<0.01)。模型組大鼠腹水出現率為83.3%，茵陳蒿組湯組腹水發生率為30.0%。

圖1 各組大鼠體重、肝重、脾重、肝體比、 脾體比及腹水發生率情況

注：A：大鼠體重、肝重、脾重重量，B：大鼠肝體比、脾體比比率，C：模型組及茵陳蒿湯組腹水率，與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與4周模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

2.2 肝功能 與正常組比較，隨著模型的加重，模型組大鼠ALT、AST、Tbil逐漸升高，4周時達到高峰，且顯著高于正常組(P<0.01或P<0.05)。血清Alb含量逐漸降低，4周時顯著低于正常(P<0.01)。與12周模型對照組比較，茵陳蒿湯組AST、ALT、Alb、Tbil顯著改善(P<0.05或P<0.01)(圖2)。

圖2 茵陳蒿湯對DMN大鼠肝纖維化模型肝功能的影響

注：與正常組比較，*P<0.05,**P<0.01,與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01。

2.3 肝組織病理 HE染色，正常組大鼠肝細胞結構清晰，排列緊密，肝細胞索由中央靜脈向四周呈放射狀排列，其間有不規則的肝竇，中央靜脈及匯管區結構正常。與正常組比較，模型組大鼠肝組織出現較廣泛的肝細胞腫脹，小葉中心性出血及灶狀壞死，伴隨大量的炎細胞浸潤，纖維組織大量增生，肝小葉結構紊亂。與模型組比較，茵陳蒿湯組肝細胞索較為規則，肝細胞變性壞死及炎細胞浸潤明顯減輕(圖3A)。

圖3 茵陳蒿湯對DMN誘導的肝纖維化大鼠肝組織病理 及膠原增生的影響

注：A、HE染色，×200；B、天狼星紅染色，×100。

圖4 茵陳蒿湯對DMN大鼠肝纖維化模型肝組織 羥脯氨酸含量的影響

注：與正常組比較，*P<0.05,**P<0.01,與模型組比較，#P<0.05,##P<0.01。

天狼猩紅染色，正常組僅血管壁見少量纖維沉積。與正常組比較，模型組彌漫分布大量增生的膠原纖維，分割肝小葉形成假小葉，膠原纖維粗大形成間隔并向肝竇內蔓延。與模型組比較，茵陳蒿湯組膠原纖維增生明顯減輕，纖維間隔變窄且疏松(圖3B)。

2.4 肝組織Hyp含量變化及膠原增生情況 DMN誘導大鼠肝硬化后，隨著造模時間延長，模型大鼠肝組織纖維化分級及Hyp含量逐漸升高，4周時達到高峰，見表1、圖4。與正常組比較，模型組大鼠肝組織Hyp含量顯著增加(P<0.01)，與模型組比較，茵陳蒿湯組組Hyp含量顯著降低(P<0.01)。

表1 肝組織膠原增生程度分期

注：與正常組比較，*P<0.05,**P<0.01,與模型組比較，#P<0.05,##P<0.01。

2.5 DMN肝纖維化大鼠組、茵陳蒿湯組肝組織差異基因分析

2.5.1 差異基因的GO富集分析 通過對模型組、茵陳蒿湯組肝組織基因原始數據進行統計，并對統計數據進行并集，以差異倍數1.5倍，P<0.05，多重假設檢驗錯誤誤判率低的標準來篩選差異基因。與4周模型組相比，在大鼠肝臟中有501個差異表達基因(P<0.05)，其中216個基因上調，285個基因下調。差異基因的GO富集分析表明有70個差異基因富集GO項。基因轉錄的變化在多種生物學過程中都變化顯著，包括抗原加工提呈的抗原處理和表達，免疫應答，炎癥反應，T細胞增殖調控，MAPK級聯反應，以及脂肪酸代謝和器官生長的負調控等。

2.5.2 通路分析 通過KEGG進行通路分析是找出差異表達基因的重要途徑。對501個差異表達的基因數據進行分析，得到47個類別的基因通路。其中14個通路在茵陳蒿湯干預治療后的大鼠肝臟中顯著富集。包括：移植物抗宿主病，Ⅰ型糖尿病，MAPK信號通路，NF-kappa B信號通路等(圖5A)。所有參與這些通路的基因：IL-1b、Cd68、Tnfrsf14、Tnfrsf9、Fas、Cd14、Ctgf、Col1a2、Igfals、Igf1、Igfbp1、Mmp12、Mmp2、Mmp23、Ccl21、Prkcb參與炎癥反應，且大多為Kcs分泌的相關因子。在DMN造模后2周Cd14、Igfals、Igfbp1下調，其余均上調。在茵陳蒿湯干預治療后基因表達得到了不同程度的修復(圖5B)。在KEGG分析中我們發現參與MAPK通路的基因較多，并在通路的上游發揮調控作用(圖5C)。根據基因間的上下游關系及他們的相互作用，構建了Gene-net-work,清楚的表達了基因間的調控關系(圖6)。

圖5 DMN肝纖維化大鼠組、茵陳蒿湯組肝組織差異基因分析

(A)對茵陳蒿湯組的差異基因通過Kegg進行通路分析，P<0.05。(B)熱圖表示選定的與Kcs相關基因及參與MAPK通路的基因，Normal表示正常組，2W表示DMN造模2周組。4W表示DMN造模4周組，YCHT表示茵陳蒿湯治療組，基因的表達水平不同，則顏色程度不同(-3到3)，紅色表示基因高表達，綠色表示基因低表達。(C)KEGGmap04010，MAPK通路。全基因芯片檢測得到的基因(P<0.05)，經Kegg pathway分析后發現KCs分泌的相關因子在MAPK通路的表達,粉色框表示與Kcs相關的基因，在MAPK通路中的位點。

3 討論

本文基于前期“茵陳蒿湯類方抗肝硬化的方證病理基礎研究”結果，圍繞“方證相關時，方劑對機體基因的調控遵循‘無差錯修復’原則”的假說，開展茵陳蒿湯調控DMN誘導的纖維化模型的基因網絡及其可能的作用機制研究。

3.1 茵陳蒿湯調控庫普弗細胞炎性因子的分泌 KCs是肝臟內特化的巨噬細胞，一般認為，各種因素引起肝臟損傷，繼之發生炎性反應。KCs活化有兩條激活途徑：經典途徑和旁路途徑[13-14]。經典途徑KCs活化并釋放多種炎性因子，這些細胞因子進一步激活靜息狀態的HSC，使之表型轉化為肌成纖維細胞，后者過度增殖并大量合成和分泌ECM成分，沉積在竇周間隙導致纖維化。旁路途徑能抑制HSD的激活，減少膠原的生物合成，從而達到抑制纖維化作用的效果。

圖6 構建網絡圖

注：Gene-net-work，根據全基因芯片檢測后得到的KCs分泌的細胞因子的上下游關系及相互間的作用構建網絡圖。不同的箭頭顏色代表不同的作用關系。A圖表示各個基因間的上下游關系及相互間的作用，B圖表示相互間作用關系(箭頭顏色的注釋)。

本研究顯示，隨著模型的進展，肝組織炎性細胞侵潤逐漸增加，ALT、AST數值逐漸增高。全基因芯片的檢測結果分析得到TNF受體及其超家族成員：Tnfrsf14、Tnfrsf9、Fas上調，結締組織、膠原酶Ctgf、Col1a2上調，胰島素樣生長因子結合蛋白：Igfals、Igf1、Igfbp1下調，基質蛋白金屬酶：Mmp12、Mmp2、Mmp23上調，蛋白酶:Prkcb上調，炎癥、趨化因子：Il-1b、CD68、CD14、Ccl21，等基因表達均上調，為KCs分泌的細胞因子，參與了KCs的經典途徑。

此結果表明炎癥是肝纖維化發生、發展的主要因素。KCs產生的細胞因子IL-1、TNF、Igf直接或間接作用于肝星狀細胞、肝細胞，促進有絲分裂、細胞轉化、調節細胞增殖，使SEC、HSC的分泌增加，導致炎癥反應的發生，使過氧化物、氧化物的產量增加，從而進一步釋放炎癥趨化因子，促進KCs的激活。CD68的過表達，促進了肝纖維化的進程[15]。

肝纖維化時，肝內過量集聚的ECM,除了HSC的激活大量產生外，還存在降解的異常。ECM的降解酶主要是基質金屬蛋白酶(MMP),是KCs分泌的生物活性因子，一般在肝纖維化的早、中期活性增高，在肝纖維化中的作用重大[16-17]。MMP-2是目前公認的肝竇內皮損傷因子，近年在臨床中已和角蛋白18新表位M30(CK-18 M30)作為檢測肝纖維化的標記物。MMP-2酶原通過與HSCs表面的MT1-MMP結合而活化，在肝纖維化早期參與了基底膜膠原的降解，使基底膜內的生長因子釋放。在肝損傷期間基質金屬蛋白酶(MMP)-2促進HSC的增殖，氧化應激通過活化MMP-2來調節HSC的的生長和侵襲[18]。MMP-23屬Ⅱ型跨膜基質金屬蛋白酶，能夠被單一的蛋白水解酶所裂解，使其具有活性和分泌作用。

在此研究中，使用茵陳蒿湯干預治療后ALT、AST水平顯著下降，IL-1β，CD68、Tnfrsf14、Tnfrsf9、COL1α2、MMP2、MMP23、Prkcb基因表達下調，CD14、Igf1基因表達上調。說明茵陳蒿湯能改善肝功能狀況，通過抑制調控KCs的經典激活途徑，抑制肝臟炎癥反應、肝星狀細胞活化及肝竇內皮細胞、肝實質損傷，從而達到抗肝纖維化的作用。

3.2 茵陳蒿湯調控MAPK信號通路 MAPK是一組可被多種信號激活，分布于胞漿中具有絲氨酸和酪氨酸雙重磷酸化能力的蛋白激酶，是真核細胞介導細胞外信號到細胞內反應的重要信號傳導系統，其通過連接細胞表面受體和細胞內關鍵調控因子參與基因的表達，經雙重磷酸化激活后，參與細胞的多種生理過程，對損傷修復、細胞增殖都具有重要的意義[19-21]。

MAPK信號通路不僅參與了細胞的生長發育及細胞周期調控等，并與炎癥及細胞間功能同樣密切相關。脂多糖是介導全身炎癥反應的重要物質，LPS可引起KCs活化，進一步激活HSC。其通過與血液循環中脂多糖結合蛋白(LBP)的復合物結合到KCs膜的CD14受體上[22]，介導MAPK活化而使效應細胞表達、合成和釋放IL-1和TNF-α等多種炎性細胞因子及花生四烯酸產物，參與炎性反應過程。MAPK通路在細胞凋亡中起著重要作用。

轉化生長因子-β(TGF-β)是肝纖維化形成中最主要的促纖維化細胞因子。它既可促進細胞外基質的合成，又可抑制其降解，在HSC活化過程中起著重要作用。TGF-β也可以誘導MAPK信號傳導通路的活化。TGF-β可以通過抑制MMPs和促進TIMPs，減少異常合成的ECM降解，改變肝纖維化的進程。

在此研究中，模型組IL-1，TNF、FAS、Prkcb等相關基因表達上調，CD14表達下調，從而調控了MAPK通路，在經過茵陳蒿干預后基因表達均得到不同程度的恢復，從而在通路上游開始阻斷了MAPK通路。

綜上所述，通過全基因芯片的分析，在DMN模型中，茵陳蒿湯干預治療后基因表達得到了不同程度的修復。前期研究表明在DMN模型中，茵陳蒿湯有效調控了肝細胞凋亡基因[6]，而在CCl4模型中，茵陳蒿湯卻沒有明顯療效，而且基因分析顯示茵陳蒿湯不僅沒有對模型中變化的上下調基因進行有效調控，反而促進了酪氨酸激酶受體(在腫瘤血管生成中發揮關鍵作用)等腫瘤相關基因的上調[6]。驗證了“方證相關時,方劑對機體基因的調控遵循‘無差錯修復’原則”的假說。茵陳蒿湯抑制DMN誘導大鼠肝纖維化形成的作用機制是非常復雜的，從目前的研究結果分析看，這種機制的形成可通調控KCs活化來抑制肝臟炎癥反應、肝星狀細胞活化、肝細胞凋亡、肝竇內皮損傷，同時可能參與調控MAPK通路來抑制肝細胞凋亡，從而達到抗肝纖維化的作用。

當然，中醫復方的成分及作用機制非常復雜，其具體調控機制、反饋調節如何進行及與其他信號通路是否有聯系等問題，尚待進一步探討。

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(2014-12-26收稿 責任編輯：洪志強)

Antifibrotic mechanism of action based on the corresponding on Traditional Chinese Medicine formula-syndrome to explore Yin-Chen-Hao Decoction regulation of Kupffer cell function and MAPK pathways

Cao Hongyan1,2，Bian Yanqin1，Wu Chao1,2，Li Jianyuan1,2，Liu Ping1,2,3，Sun Mingyu1,2,3

(1ShuguangHospital,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine;InstituteofLiverDisease,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China; 2KeyLaboratoryofLiverandKidneyDiseases(MinistryofEducation),ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China;3E-instituteofShanghaiMunicipalEducationCommission,Shanghai201203,China)

Objective: Our previous study showed significantly efficacy of series formula of Yin-chen-hao Decoction (YCHD) on fibrosis models in rats induced dimethynitrosamine (DMN).From the perspective of formula-efficacy-syndrome, we proposed a hypothesis ‘corresponding permit on formula-syndrome, gene regulation of formula on suffering body follow ‘error free repair’ principle’ and explore the mechanism of action of YCHD. Methods: Liver fibrosis was induced in rats with DMN. YCHD was administrated intragastrically for 2 weeks for rats. At the end of the fourth week, all of the animals were sacrificed and their liver samples were collected for histology and gene chip analyses. Results: Compared with the normal group, the blood serum ALT level of the rats was remarkably increased (P<0.01) four weeks after modeling; the inflammatory cells of hepatic tissue was remarkably infiltrated according to pathological observance, the deposition of collagen was remarkable (P<0.01). There were remarkable up-regulation of the expression of the genes including Interleukin 1 beta (IL-1b), Cd68, Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 14 (Tnfrsf14), Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 9 (Tnfrsf9), Fas, Cd14,Connective tissue growth factor (Ctgf), Collagen, type I, alpha 2(Col1a2), Insulin-like growth factor binding protein, acid labile subunit( Igfals), Insulin-like growth factor 1( Igf1),Insulin-like growth factor binding protein 1(Igfbp1), Matrix metallopeptidase 12(Mmp12), Matrix metallopeptidase 2(Mmp2), Matrix metallopeptidase 23(Mmp23), Chemokine ligand 21(Ccl21) and Protein kinase C, beta (Prkcb) in hepatic tissue, and mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway was activated. Yin-Chen-Hao Decoction significantly reduced the level of blood serum ALT inducted by DMN, restrained the infiltration and necrosis of the inflammatory cells of hepatic tissue, inhibited collagen deposit, decreased the expression of the genes including IL-1b, Cd68, Tnfrsf14, Tnfrsf9, Fas, Cd14, Ctgf, Col1a2, Igfals, Igf1, Igfbp1, Mmp12, Mmp2, Mmp23, Ccl21 and Prkcb, and restrained the activation of MAPK pathway. Conclusion: The hypothesis ‘corresponding permit on formula-syndrome, gene regulation of formula on suffering body follow ‘error free repair’ principle’ was verified. The MOA of anti-fibrotic of Yin-Chen-Hao Decoction was regulation of the KCs action and MAPK pathway.

Corresponding on Traditional Chinese medicine formula-syndrome; Hepatic fibrosis; Yin-Chen-hao Decoction; ‘Error free repair’ principle; Gene analysis

國家自然科學基金項目(編號：81273729，30701070)；上海中醫藥大學首屆杏林學者、上海市重點科技攻關項目(編號：11DZ1971702)；上海高校創新團隊建設項目、國家中醫藥管理局中醫肝膽病重點學科、慢性肝病虛損重點研究室和上海市中醫臨床重點實驗室資助

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.02.004