柔肝固腸方改善慢性酒精性肝損傷大鼠腸道通透性的機制研究

姚東升 胡義揚 傅琪琳 顧宏圖 徐 琳 王文靜 彭景華 趙 瑜 馮 琴

(上海中醫藥大學附屬曙光醫院，上海中醫藥大學肝病研究所，上海高校中醫內科學E-研究院，肝腎疾病病證實驗室，上海市中醫臨床重點實驗室，上海，201203)

柔肝固腸方改善慢性酒精性肝損傷大鼠腸道通透性的機制研究

姚東升 胡義揚 傅琪琳 顧宏圖 徐 琳 王文靜 彭景華 趙 瑜 馮 琴

(上海中醫藥大學附屬曙光醫院，上海中醫藥大學肝病研究所，上海高校中醫內科學E-研究院，肝腎疾病病證實驗室，上海市中醫臨床重點實驗室，上海，201203)

目的：從腸道緊密連接及黏附連接角度探討柔肝固腸方改善慢性酒精性肝損傷大鼠腸道通透性的作用機制。方法：Lieber-DeCarli酒精液體飼料飼養6周誘導大鼠慢性酒精性肝損傷模型。30只SD雄性大鼠，隨機分無酒精液體飼料對照組(對照組，n=10)和酒精液體飼料造模組(n=20)，造模第4周將造模組大鼠隨機分模型組(n=10)，柔肝固腸方組(n=10)，并開始灌胃給柔肝固腸方或蒸餾水直至6周末，取材前3.5 h各組以10 mg/ kg的內毒素(LPS)灌胃。取材后檢測：1)血清AST、ALT活性變化；2)通過門脈血漿內毒素含量測定判斷小腸通透性變化；3)小腸組織電鏡超微結構觀察；4)小腸緊密連接蛋白ZO-1、Occludin蛋白與mRNA表達變化；5)小腸黏附連接蛋白β-Catenin和E-Cadherin蛋白表達。結果：1)柔肝固腸方可顯著降低模型大鼠顯著升高的AST水平(P<0.05)；2)柔肝固腸方可降低模型大鼠顯著升高的小腸通透性，柔肝固腸方組血漿內毒素含量顯著低于模型組；3)電鏡結果顯示柔肝固腸方可顯著改善Lieber-DeCarli酒精飼料喂養大鼠小腸黏膜表面微絨毛局灶性減少、變短、稀疏，排列不規則，同微絨毛相連的細胞終末網變性模糊等病理改變；4)柔肝固腸方可顯著升高酒精飼料喂養肝損傷大鼠小腸組織緊密連接蛋白ZO-1、Occludin蛋白與mRNA表達及黏附連接蛋白β-Catenin和E-Cadherin蛋白表達。結論：柔肝固腸方通過改善腸上皮緊密連接及黏附連接改善慢性酒精性肝損傷大鼠腸道通透性改變。

酒精性肝損傷；柔肝固腸方；腸道通透性；緊密連接；黏附連接

酒精性肝病(Alcoholic Liver Disease，ALD)是由于長期大量飲酒所導致的肝臟疾病。近些年來，研究證實腸道屏障功能障礙與酒精性肝損傷關系密切，酒精所致腸道通透性改變血中內毒素升高是形成酒精性肝病“二次攻擊”理論的核心要素之一[1-2]。改善酒精所致的腸道屏障損傷，減少腸源性內毒素入血，為治療ALD的重要和有效途徑。

“飲食所傷”是酒精性肝病中醫學重要的病因學說之一，調理脾胃運化功能是中醫藥治療酒精性肝病的主要治法治則[3]。筆者所在研究所根據健脾活血立法創立的由白術、茯苓、白芍、澤瀉等組成的“健脾活血方”臨床治療酒精性肝損傷療效顯著，近10多年來系列研究證實其通過改善腸道通透性、抗內毒素二次攻擊以及抗脂質過氧化等多途徑發揮抗酒精誘導的大鼠肝損傷的作用[4-6]。前期研究提示白芍、五味子及澤瀉三味藥(命名為“柔肝固腸方”)是健脾活血方8味中藥中改善小腸通透性改變的主效應中藥組合[7]。本研究采用Lieber-Decarli酒精飲料誘導的大鼠酒精性損傷模型，從腸道緊密連接及黏附連接角度探討柔肝固腸方改善慢性酒精性肝損傷大鼠腸道通透性的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物 SD雄性大鼠，SPF級，體重130～160 g，30只，合格證號SCKC-滬-2008-0016，購自上海必凱實驗動物有限公司。特制籠具單籠飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心。特制Richter飼料瓶(負壓飼料瓶)予大鼠自動飲用液體飼料。

1.2 藥物 柔肝固腸方由白芍、五味子、澤瀉組成。五味子加70%乙醇提取2次，過濾，回收乙醇；澤瀉、白芍分別水提，濾液冷藏備用，臨用前將三種藥混合配成懸濁液。給藥時配制成10 mL/kg鼠重的灌胃液。中藥購自上海華宇藥業有限公司，上海中醫藥大學科技中心制備。

1.3 試劑 血清丙氨酸氨基轉移酶(Alanine Aminotransferase，ALT)、門冬氨酸氨基轉移酶(Aspartate Aminotransferase，AST)測定試劑盒購自南京建成生物制品研究所；內毒素檢測試劑盒(貨號21080309C/BU0209)購自美國ACC公司；ZO-1多克隆抗體(貨號SC-10804)、E-cadherin(貨號sc-7870)，購自santacruz公司；Occludin多克隆抗體(貨號ab31721)，購自abcam公司；a-tublin多克隆抗體(貨號2251-1)，購自EPITOMICS公司。β-Catenin抗體(貨號9582S)，購自CST公司；柱式小量總RNA抽提試劑盒，購自上海華舜生物工程有限公司；cDNA合成試劑盒，購自Fermentas公司；引物由TAKARA公司設計、上海生工生物工程技術服務有限公司合成。熒光定量PCR試劑盒，購自TAKARA公司產品；引物序列及片段長度如下(表1)。

表1 引物序列及片段長度

2 方法

2.1 模型制備 Lieber-DeCarli酒精性大鼠肝損傷模型制備及取材方法，參照本課題組已發表文獻[4]。

2.2 分組與給藥 大鼠30只，隨機分無酒精液體飼料對照組(對照組，n=10)和酒精液體飼料造模組(造模組，n=20)，造模第4周將造模大鼠隨機分模型組(n=10)，柔肝固腸方組(n=10)，柔肝固腸方組在給予酒精飼料的同時，灌胃給予1 mL/100 g體重藥物，1次/d，模型組、對照組按相同標準灌胃給予飲用水。

2.3 觀察指標及方法 1)血清AST、ALT活性，賴氏法。2)小腸通透性通過門靜脈血漿內毒素含量檢測判定(鱟試劑法)。3)小腸組織電鏡超微結構觀察。4)小腸緊密連接蛋白ZO-1及Occludin蛋白及mRNA表達變化，Western Blotting(WB)和Real-time PCR(RT-PCR)方法。5)小腸黏附連接蛋白β-Catenin和E-Cadherin蛋白表達，WB方法。

3 結果

3.1 各組大鼠死亡情況、進食量、體重變化 造模開始及結束時各組大鼠體重均無統計學意義(P>0.05)(見表2)；在造模過程中各組大鼠進食量無統計學意義(P>0.05)(見表2)，其所攝入的乙醇量和熱卡也大致相等，排除了飲食及乙醇量的差異對實驗結果的影響；造模第6周柔肝固腸方組有1只大鼠因灌胃不當意外死亡。

表2 各組大鼠體重及進食量±s)

3.2 柔肝固腸方對慢性酒精性肝損傷大鼠血清AST、ALT的影響 與對照組相比，模型組血清ALT、AST活性顯著升高；與模型組相比，柔肝固腸方組能顯著降低血清AST活性。(見表3)。

表3 各組大鼠血清ALT、AST含量

注：**P<0.01，*P<0.05，vs對照組；##P<0.01，vs模型組。

3.3 柔肝固腸方對慢性酒精性肝損傷大鼠腸道通透性(門靜脈血漿內毒素含量)的影響 模型組大鼠門靜脈血漿內毒素含量較對照組組明顯升高(P<0.05)，柔肝固腸方組門靜脈血漿內毒素含量有顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05)(表4)

表4 各組大鼠門靜脈血漿內毒素含量±s)

注：*P<0.05，vs對照組；##P<0.01，#P<0.05，vs模型組。

3.4 柔肝固腸方對慢性酒精性肝損傷大鼠小腸組織超微結構的影響 對照組小腸黏膜超微結構未見明顯改變。模型組大鼠小腸黏膜表面微絨毛局灶性減少、變短、稀疏，排列不規則。同微絨毛相連的細胞終末網變性模糊。柔肝固腸方小腸黏膜表面上皮細胞間各種連接結構較為清晰，微絨毛局灶性稀疏、減少等有所改善，上皮細胞變性程度輕微。(圖1)

圖1 小腸電鏡超微結構變化(11500倍)

注：N對照組，M模型組，R柔肝固腸方組。

3.5 柔肝固腸方對對慢性酒精性肝損傷大鼠小腸緊密連接蛋白ZO-1、Occludin蛋白及mRNA表達的影響 與對照組相比，模型組小腸ZO-1、Occludin蛋白表達顯著降低；柔肝固腸方組ZO-1蛋白表達較模型組均顯著升高。(圖2)

與對照組相比，模型組小腸組織ZO-1mRNA表達無顯著變化，Occludin mRNA表達顯著降低，柔肝固腸方組ZO-1、OccludinmRNA表達均顯著升高。(表5)

圖2 各組小腸ZO-1、Occludin蛋白表達情況

注：N：對照組，M：模型組，R：柔肝固腸方組。

表5 各組大鼠小腸組織ZO-1、Occludin mRNA表達

注：**P<0.01，vs對照組；##P<0.01，#P<0.05，vs模型組。

3.6 柔肝固腸方對小腸黏附連接蛋白β-Catenin、E-Catenin影響 與對照組相比，模型組小腸β-Catenin、E-Catenin蛋白表達均顯著降低；柔肝固腸方組較模型組均顯著升高。(圖3)

圖3 各組小腸β-Catenin、E-Catenin蛋白表達情況

注：N：對照組，M：模型組，R：柔肝固腸方組

4 討論

ALD發病原因明確，為過量攝入乙醇所致。乙醇所致血中內毒素升高是形成酒精性肝病(ALD)“二次攻擊”理論的要素之一。乙醇導致腸道黏膜屏障的破壞，形成腸滲漏被認為是乙醇誘導的內毒素血癥的主要原因，因此通過改善腸道屏障功能抑制內毒素升高是ALD治療學上的重要策略[2]。

柔肝固腸方是臨床治療ALD有效經驗方健脾活血方中改善小腸通透性改變的主效應中藥組合[7]，研究證實其可減輕酒精性肝損傷，且其改善小腸通透性有優于健脾活血方的趨勢。但其通過何種機制改善腸道屏障功能尚不明了，有必要進一步深入研究。

腸道屏障功能是指能防止腸腔內有害物質如細菌及毒素等穿過腸黏膜進入體內其他組織器官和血液循環的結構和功能，主要由腸道黏膜的機械屏障、免疫屏障、化學屏障和生物屏障四部分組成[8]。機械屏障是其中最重要的部分，小腸上皮機械屏障功能主要由上皮細胞細胞間連接復合物包括緊密連接和黏附連接提供[9]。其中緊密連接是調節細胞間通透性的細胞間連接復合物中最重要的組分，是防御異物入血的第一道防線[10]。緊密連接[10-11]是由超過50種蛋白質組成的結構復雜的復合體，通過連接與細胞骨架結構連接的復合物蛋白構成緊密連接復合物來吻合封閉細胞間隙。緊密連接胞內蛋白主要是ZO-1蛋白，其起到橋梁的作用。一方面，ZO-1自身的C末端同肌動蛋白骨架系統相連接，另一方面，ZO-1通過鳥苷酸激酶樣(GUK)結構域的保守序列，與緊密連接的跨膜蛋白蛋白如Occludins蛋白的C末端連接。最終，將Occludin蛋白和肌動蛋白骨架系統連接在一起，構成穩定的連接系統。Occludin蛋白是主要集中于緊密連接纖維內相對分子質量約為65 000的Ⅱ型跨膜蛋白，其蛋白的胞外環型結構及跨膜結構主要參與腸壁通透性的調節。緊密連接蛋白的破壞會導致腸道通透性增高，使大分子物質，如內毒素、病原體等從腸腔進入血液。黏附連接[12]為腸道機械屏障的另一重要組成部分。一般于上皮細胞頂側面的緊密連接下方形成粘合帶(Adhesion Belt)。在粘合帶處相鄰細胞的間隙約15～20 nm。間隙中的粘合分子為E-鈣粘蛋白(E-cadherin)。粘合帶處的質膜下方有與質膜平行排列的肌動蛋白束，鈣粘蛋白通過附著β-連鎖蛋白(β-catenin)等連鎖蛋白、粘著斑蛋白(Vinculin)、α-輔肌動蛋白(α-actinin)和片珠蛋白(Plakoslobin)與肌動蛋白束相結合。于是，相鄰細胞中的肌動蛋白絲束通過鈣粘蛋白和附著蛋白編織成了一個廣泛的網絡，把相鄰細胞聯合在一起。近來研究發現乙醇代謝產物乙醛可通過介導E-cadherin與β-catenin的酪氨酸磷酸化而且破壞黏附連接蛋白。

本研究運用Lieber-Decarli酒精飼料喂養大鼠6周誘導慢性酒精性肝損傷模型，并參照文獻方法[5]，于動物處死前3.5 h給予內毒素灌胃，取材后測定門靜脈血漿血內毒素含量以評價腸道通透性。結果顯示模型大鼠門靜脈血漿內毒素含量較無酒精飼料對照大鼠顯著升高，說明該模型中腸滲漏發生，存在腸道屏障受損。小腸組織電鏡超微結構也顯示酒精飼料喂養大鼠出現小腸黏膜表面微絨毛局灶性減少、變短、稀疏，排列不規則，同微絨毛相連的細胞終末網變性模糊等病理改變。同時，WB研究結果顯示模型大鼠小腸組織緊密連接蛋白ZO-1、Occludin及黏附連接蛋白β-Catenin、E-cadherin蛋白表達均顯著低于無酒精飼料對照大鼠，提示小腸上皮緊密連接與黏附連接的破壞是該慢性酒精性肝損傷模型腸道通透性升高的主要原因。經中藥柔肝固腸方治療后，模型大鼠血清AST顯著降低同時伴有腸道通透性關鍵指標——血漿門靜脈內毒素含量的顯著降低及小腸黏膜超微結構的好轉，提示改善腸通透性抑制內毒素血癥是該方有效治療酒精性肝損傷的重要機制之一。進一步檢測該方對小腸上皮緊密連接與黏附連接關鍵蛋白的影響，結果顯示無論緊密連接蛋白ZO-1、Occludin還是黏附連接蛋白β-Catenin、E-cadherin經過柔肝固腸方治療后蛋白表達均較模型組顯著升高，提示緩解慢性酒精攝入導致的腸上皮細胞緊密連接及黏附連接破壞是該方修復腸道黏膜機械屏障、改善腸道通透性的主要機制。

綜上所述，柔肝固腸方可通過修復腸上皮細胞緊密連接及黏附連接而改善酒精性腸道通透性改變起到防治ALD的作用。這為該方臨床運用與新藥開發提供科學依據同時，也為從“肝-腸軸”角度開展中醫藥防治酒精性肝病的研究提供可借鑒的思路與方法。

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(2014-12-26收稿 責任編輯：洪志強)

Mechanism research of Rouganguchang Decoction on improving intestinal permeability changes of rats with ethanol-induced liver injury

Yao Dongsheng, Hu Yiyang, Fu Qilin, Gu Hongtu, Xu Lin, Wang Wenjing, Peng Jinghua， Zhao Yu, Feng Qin

(InstituteofLiverDiseases,ShuguangHospitalAffiliatedtoShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicinet,Shanghai201203,China)

Objective:From the intestinal tight junction and adherens junction pathway to explore mechanism research of Rouganguchang Decoction on improving chronic alcoholic liver injury and intestinal permeability changes. Methods: The rats were given Lieber-Decarli liquid diet daily for 6 weeks to duplicate the alcoholic liver injury model. Thirty male Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into control liquid diet, control group (control group, n = 10) and ethanol liquid diet model group (n = 20). Model rats were randomly divided into the model group (n = 10), Rouganguchang Decoction group (n = 10) the fourth weeks. The rats were given decoction or distilled water from the fourth week to the sixth weekend. Each rat was given 10mg/kg endotoxin (LPS) by gavage 3.5h before being sacrificed. The following indexes were detected: 1)The ALT、AST activity of serum were detected by biochemical method; 2)LPS content in the portal blood was detected by biochemical method; 3)Pathological changes in intestinal tissues were observed by electron microscope; 4)The protein and mRNA expresses of ZO-1 and Occludin were detected by Western blotting and real-time PCR respectively; 5)The protein of beta-Catenin and E-Cadherin were detected by Western blotting. Results:1) Compared with that of the model group rats, the activity of AST in drug group decreased significantly (P<0.05); 2) The plasma endotoxin levels of Rouganguchang Decoction decreased significantly compared with that of the model group rats; 3) Rouganguchang Decoction could improve the intestinal mucosa connection structure of the surface epithelial cells of model rats; 4) Compared with those of the model group rats, the protein and mRNA expressions of ZO-1 and occludin, as well as the protein expressions of beta-Catenin and E-Cadherin all increased. Conclusion: Rouganguchang Decoction can significantly improve chronic alcoholic liver injury and intestinal permeability changes, the mechanism of that was related to protection of intestinal epithelial tight junctions and adhesion junctions.

Alcoholic liver injury; Rouganguchang Decoction; Intestinal permeability; Intestinal tight junctions; Intestinal adhesion junctions

國家自然基金青年基金項目(編號：30801536)；國家中醫藥管理局中醫肝膽病重點學科資助項目

R256.43

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.02.006