扶正化瘀組分復方抑制血管新生的抗肝纖維化作用機制

呂 靖 譚 燁 趙志敏 黃 愷 沈 麗 陶艷艷 劉 平 劉成海，，4，5

(1 上海中醫藥大學附屬曙光醫院·肝硬化科，上海，201203; 2 上海中醫藥大學附屬曙光醫院·肝病研究所，上海，201203; 3 上海市中醫臨床重點實驗室，上海，201203; 4 上海高校中醫內科學E-研究院，上海，201203; 5 肝腎疾病病證教育部重點實驗室，上海，201203)

扶正化瘀組分復方抑制血管新生的抗肝纖維化作用機制

呂 靖1譚 燁2趙志敏3黃 愷3沈 麗2陶艷艷2劉 平2劉成海2，3，4，5

(1 上海中醫藥大學附屬曙光醫院·肝硬化科，上海，201203; 2 上海中醫藥大學附屬曙光醫院·肝病研究所，上海，201203; 3 上海市中醫臨床重點實驗室，上海，201203; 4 上海高校中醫內科學E-研究院，上海，201203; 5 肝腎疾病病證教育部重點實驗室，上海，201203)

目的：本研究旨在探討扶正化瘀組分復方的抗肝纖維化作用及其作用機制。方法：采用DMN誘導小鼠肝纖維化模型，以扶正化瘀方為陽性對照。以天狼猩紅染色和羥脯氨酸含量評估肝纖維化程度；肝臟微血管成像和CD31標記微血管密度評價肝臟血管新生；western blot法檢測肝組織VEGF-R2表達；通過計數轉基因斑馬魚功能性節間血管數和堿性磷酸酶活性驗證藥物對血管的影響。結果：扶正化瘀組分復方可顯著改善纖維化小鼠血清肝功能(P<0.01)：減少肝組織膠原沉積(P<0.01)；減少肝臟微血管數量(P<0.01)；下調VEGFR2蛋白表達(P<0.01)；抑制斑馬魚堿性磷酸酶活性。結論：扶正化瘀組分復方具有抑制DMN誘導小鼠肝纖維化模型肝組織纖維化的作用，其作用機制可能與抑制血管新生有關。

肝纖維化；血管新生；扶正化瘀組分復方

血管新生是一個廣泛存在的病理生理過程，表現為芽生性血管新生和套疊性血管新生，在生長發育、傷口愈合、心肌梗死、腦中風、腫瘤等方面均扮演著重要角色。近年研究表明，不僅肝癌的發生發展與血管新生密切相關，肝纖維化、肝硬化的發生發展也與血管新生有重要關聯[1-5]。肝癌靶向藥物布立尼布(Brivanib)、索拉非尼(Sorafenib)和舒尼替尼(Sunitinib)等小分子受體酪氨酸激酶抑制劑，已被證實可抑制血管新生、減輕肝纖維化和降低門脈高壓[6-8]。血管新生成為肝纖維化形成與逆轉的關鍵環節。

作為抗纖維化中藥新藥的扶正化瘀膠囊，經臨床證實其肝組織纖維化逆轉率為52%[9]。但因該方組成成分復雜、藥理活性多樣，成為發展瓶頸。以該方為基礎，通過分析、提煉其有效成分，并根據其藥理活性重組成新的組分成分復方，為新一代抗肝纖維化中藥研發奠定基礎，是我們“十一五”重大科技專項的主要任務之一。在既往工作中，我們構建了肝腎纖維化中藥新藥發現與評價平臺，發現了扶正化瘀方主要效應成分，并以多種細胞模型(人肝細胞LO2細胞系過氧化損傷模型、人肝星狀細胞LX2細胞系活化增殖模型、人肝癌內皮細胞SK-HEP-1細胞系損傷和活化增殖模型)進行藥效評價，據此優化組合為新的組分復方(丹參酮ⅡA∶丹酚酸B∶蟲草素∶扁桃苷∶槲皮素∶原人參三醇∶五味子乙=1∶1∶1∶1∶1∶1∶1)。本文旨在采用整體動物模型對該組分復方進行進一步藥效評價，并探討其部分作用機制。

1 材料

1.1 動物 ICR小鼠，雄性，5周齡，(25±1)g，SPF級，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2012-0001。所有小鼠飼養于上海中醫藥大學動物實驗中心SYXK(滬)2009-0069，自由飲食。

血管內皮生長因子受體2-綠色熒光蛋白轉基因斑馬魚(VEGFR2-GFP Transgenic Zebrafish Lines)，源于山東省科學院生物研究所。

1.2 藥品 扶正化瘀方(FZHY)(國藥準字Z20050546)，24 g/劑，含丹參4 g，桃仁2 g，絞股藍6 g，松花粉2 g，蟲草菌絲8 g，五味子2 g。其浸膏粉由上海現代中醫藥技術發展公司提供。PTK787，VEGFR酪氨酸激酶抑制劑，購自Sigma。丹參酮ⅡA、丹酚酸B、蟲草素、扁桃苷、槲皮素、原人參三醇、五味子乙購自上海融禾醫藥科技發展有限公司。

2 方法

2.1 肝纖維化模型的制備 N-亞硝基二甲胺(N-Nitrosodimethylamine，NDMA)配制成0.1%(V/V)NDMA溶液，以0.05 mL/10 g腹腔注射，1次/d，共3周。

2.2 分組與用藥 ICR小鼠，雄性，5周齡，(25±1)g，隨機分為正常對照組8只，正常加組分復方對照組8只，模型對照組12只，扶正化瘀方組11只，扶正化瘀組分復方低、中、高劑量各組每組12只。自第5周開始灌，按0.1 mL/10 g計算，每日2次，共3周。其中扶正化瘀方組以48 mg/(10 g·d)劑量灌胃，扶正化瘀組分復方(丹參酮ⅡA∶丹酚酸B∶蟲草素∶扁桃苷∶槲皮素∶原人參三醇∶五味子乙=1∶1∶1∶1∶1∶1∶1)低、中、高劑量組分別以(0.05×7)μmol/(10 g·d)、(0.1×7)μmol/(10 g·d)、(0.2×7)μmol/(10 g·d)劑量灌胃，正常加組分復方組不建模，按組分復方高劑量給藥。

2.3 血清肝功能檢測 谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)測定，賴式比色法；白蛋白(Alb)測定，溴甲酚綠比色法；乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase，AchE)測定，乙酰膽堿羥胺法；總膽固醇(Total Cholesterol，TC)測定，膽固醇酯氨基安替吡啉法。

2.4 肝組織病理染色 肝組織經4%甲醛液固定，石蠟包埋，4 μm切片，二甲苯、多級乙醇脫蠟至水，天狼猩紅染色，并用Olympus IX70倒置顯微鏡拍攝。

2.5 肝組織纖維化生化測定 組織羥脯氨酸(Hydroxyproline，Hyp)含量測定，參照Jamall's鹽酸水解法[10]；組織單胺氧化酶(Monoamine Oxidases，MAO)，芐胺環己烷法；組織脯氨酰羥化酶(Prolyl Hydroxylase，PH)，免疫法。

2.6 同步輻射X線二維成像肝臟血管 每只鼠留取一整葉肝臟，經4%甲醛液固定，梯度乙醇脫水，采用9 μm探測器，X線二維成像觀察肝臟血管，實驗于上海光源X線成像及生物醫學應用光束(BL13W1)線站完成。圖像重組，采用image-pro plus 6.1圖像分析軟件，在三級血管區域隨機選取3個相同面積視野，對視野內血管長度進行求和，并求平均值。

2.7 免疫熒光染色及微血管密度計算 肝組織冰凍切片7 μm，冰丙酮固定10 min，PBS洗滌2次，0.2%小牛血清白蛋白室溫封閉1 h，一抗37 ℃孵育90 min，PBS洗滌3次，相應的熒光二抗37 ℃孵育1 h，DAPI染核5 min，PBS洗滌3次，抗熒光淬滅封片液封片，熒光顯微鏡下觀察。參照Weidner等[11]的方法通過免疫熒光檢測CD31蛋白表達計算微血管密度(Microvessel Density，MVD)，低倍鏡下觀察整個切片，尋找血管密度最高的區域，然后高倍鏡下每張切片隨機選取5個視野，采用image-pro plus 6.1圖像分析軟件計算每個視野陽染微血管數目，并求平均值。

2.8 轉基因斑馬魚分組與用藥 隨機分為空白對照組、陽性對照PTK787組、扶正化瘀方組、扶正化瘀組分復方低、中、高劑量組。體式顯微鏡下挑選發育24 h的VEGFR2-GFP轉基因斑馬魚胚胎，移入96孔板，每孔一個。樣孔中已預先加入受試溶液，每5孔一組，讓胚胎繼續發育至48 h，麻醉，熒光顯微鏡下觀察，記錄節間血管血流數。4%多聚甲醛固定，脫水，透化，堿性磷酸酶染色，顯微鏡下拍照。由山東省科學院生物研究所檢測完成。

3 結果

3.1 組分復方對肝纖維化小鼠肝功能的影響 與正常組比，模型組谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)明顯升高(P<0.01)，白蛋白(Alb)、乙酰膽堿酯酶(AchE)、總膽固醇(TC)顯著下降(P<0.01)，正常加組分復方組TC亦顯著下降(P<0.01)；與模型組比，扶正化瘀方和組分復方各組ALT、AST顯著下降，Alb、AchE、TC顯著升高(P<0.01)；與扶正化瘀方組相比，組分復方低劑量組ALT較高(P<0.01)，組分復方各組AchE(中、高劑量)、TC較低(P<0.05)。(見表1)。

表1 組分復方對DMN誘導肝纖維化小鼠肝肝功能的影響±s)

注：**與正常對照組比，P<0.01；△△與模型對照組比，P<0.01；▲▲與扶正化瘀方組比，P<0.01；▲與扶正化瘀方組比，P<0.05。

3.2 組分復方對肝纖維化小鼠肝組織膠原沉積的影響 天狼猩紅染色結果顯示：正常組和正常加組分復方對照組小鼠匯管區可見少量膠原沉積；與正常組比，模型組小葉結構破壞，匯管區膠原纖維沉積、延伸，相互交聯形成多個假小葉結構；與模型組比，扶正化瘀方和組分復方低、中、高劑量組膠原纖維沉積均不同程度地減輕(見圖1)。肝組織羥脯氨酸(Hyp)、組織單胺氧化酶(MAO)、組織脯氨酰羥化酶(PH)結果顯示：與正常組相比，模型組Hyp、MAO、PH顯著升高(P<0.01)，正常加組分復方組無統計學意義；與模型組比，扶正化瘀組及各組分復方治療組Hyp、MAO、PH均有明顯降低(P<0.01)；與扶正化瘀組比，組分復方高劑量組MAO、PH顯著降低(P<0.05)；組分復方各組隨著藥物劑量加大Hyp、MAO、PH檢測值逐漸降低(見表2)。

圖1 組分復方降低肝纖維化小鼠肝組織膠原 沉積(sirus red染色，×200)

注：NC：正常對照組，TC：正常加組分復方對照組，MC：模型對照組，PF：扶正化瘀方對照組，EL：組分復方低劑量組，EM：組分復方中劑量組，EH：組分復方高劑量組。下同。

表2 組分復方對DMN誘導肝纖維化小鼠肝組織

注：**與正常對照組比，P<0.01；△△與模型對照組比，P<0.01；▲與扶正化瘀方組比，P<0.05。

3.3 組分復方對肝纖維化小鼠肝組織微血管的影響 同步輻射X線二維成像肝臟血管顯示：正常組和正常加組分復方組肝血管各級支粗細適中邊緣清楚；模型組肝血管各級分支明顯增多伴走行雜亂呈網狀，可見部分微血管扭曲，且全葉血管邊緣粗糙；與模型組比，扶正化瘀方組和組分復方低、中、高劑量組各級分支稍多，部分血管邊緣粗糙，有所改善(圖2A)。圖像分析軟件結果顯示：與正常組比，模型組相對血管長度明顯增加(P<0.01)，正常加組分復方組無統計學意義；與模型組比，扶正化瘀方組相對血管長度明顯減少(P<0.01)，組分復方中、高劑量組相對血管長度有所減少(P<0.05)(圖2C)。CD31標記肝臟血管并計算微血管密度(MVD)結果也證實上述結果。正常組和正常加組分復方組肝組織表達少量CD31；與正常組比，模型組肝組織CD31陽染及MVD明顯增加(P<0.01)；與模型組比，扶正化瘀方及組分復方各組CD31表達及MVD計數明顯減少(P<0.01)；與扶正化瘀方組相比，各組分復方治療組微血管密度無統計學意義(圖2B)(圖2D)。

圖2 組分復方改善肝纖維化小鼠肝組織血管情況

注：(A)同步輻射X線二維成像(B)CD31免疫熒光染色(C)A圖血管長度半定量分析(D)CD31標記微血管密度計算.**與正常對照組比，P<0.01；△△與模型對照組比，P<0.01；△與模型對照組比，P<0.05；▲▲與扶正化瘀方組比，P<0.01。

3.4 組分復方對肝纖維化小鼠肝組織VEGFR2表達的影響 Western Blot結果顯示：與正常組比，模型組VEGF-R2表達上調35.0%(P<0.01)，正常加組分復方組未見統計學意義；與模型組比，扶正化瘀與組分復方各組VEGF-R2表達均可見不同程度的下調(P<0.01)；與扶正化瘀方組比，各組分復方組VEGF-R2表達有所下降(P<0.05)(圖3)。

圖3 組分復方下調肝纖維化小鼠肝組織VEGF-R2表達

3.5 組分復方對VEGFR2-GFP斑馬魚功能性節間血管計數和堿性磷酸酶活性的影響 與空白對照組比，陽性對照PTK787組(PP)功能性節間血管數完全抑制(P<0.01)，扶正化瘀方組(PF)功能性節間血管數明顯抑制(P<0.05)，各組分復方組功能性節間血管數略有抑制趨勢，但無統計學意義；各組分復方組相比，隨著劑量加大，功能性節間血管數呈進一步減少趨勢，但無統計學意義。(見圖4A，表3)。與正常對照組相比，PP組堿性磷酸酶活性完全降低，PF組與各組分復方組堿性磷酸酶活性均有明顯降低(見圖4B)。

圖4 扶正化瘀組分復方可抑制斑馬魚血管生成 減少功能性節間血管(圖A)，降低堿性磷酸酶活性(圖B)表3 扶正化瘀組分復方對斑馬魚功能性節間 血管計數的影響±s)

組別斑馬魚數功能血管數空白對照組526.67±2.67PTK787組50**扶正化瘀方組520.53±1.52*組分復方低劑量組525.25±2.07組分復方中劑量組525.02±2.49組分復方高劑量組524.55±2.28

注：*與正常對照組相比，P<0.05；**與正常對照組相比，P<0.01。

4 討論

肝纖維化是由不同病因所致的慢性肝病進展至肝硬化的必經過程，積極防治肝纖維化具有重要意義[12-15]。在對肝纖維化的自然發展史及抗肝纖維化療效的分析中，我們認識到：即使同一病因引起的肝硬化，其發生發展速度也不同，而且對同一干預藥物的反應也不一致。除了宿主因素即機體的基因背景、飲食生活環境外，肝纖維化自身特點也是一個重要因素。肝纖維化可分為靜止性和活動性兩類，病理上活動性肝纖維化呈現纖維間隔中血管新生活躍的特點。此外，目前研究證實，肝血管新生與肝纖維化密切相關，其既在纖維化之前發生，又伴隨纖維化的進展不斷加重，從而構成肝纖維化難以逆轉及門脈高壓的病理生理基礎，且為肝硬化并發癥包括肝癌發生發展的重要因素，而抑制肝血管新生可以逆轉實驗性肝纖維化。熒光血管造影術可見肝硬化大鼠肝臟顯著的血管新生，形成一個雜亂無章的血管網絡，與肝竇結構與功能異常有關[8]。使用受體酪氨酸激酶抑制劑Brivanib[6]、Sorafenib[7]或Sunitinib[8]干預血管新生，可減輕肝纖維化。綜上所述，血管新生性肝纖維化是肝硬化發展的重要病理基礎，因此，基于肝血管新生發現有效活性藥物及其相應作用機制有重要意義。

本實驗研究結果表明：1)扶正化瘀組分復方可減輕DMN誘導的肝纖維化模型小鼠肝組織纖維化：肝組織Hyp含量、天狼猩紅染色結果證實了這一點。2)扶正化瘀組分復方可抑制血管新生：一方面，可改善肝纖維化小鼠肝組織微血管、降低CD31陽染微血管密度，下調VEGF-R2蛋白表達；另一方面，可抑制VEGFR2-GFP斑馬魚堿性磷酸酶活性。

肝臟的血管新生不同于其他器官，有其特殊性，主要原因是存在兩種不同的微血管結構：大血管和肝竇，前者是連續性血管內皮，后者是具有窗孔結構的非連續性內皮。前者表現為CD31、vWF等連續性血管內皮標志物表達增加，也就是微血管密度增加；而后者則不然，主要表現為肝竇內皮細胞去分化。正常的肝竇內皮細胞(LSEC)在胚胎發育早期就失去了連續性內皮標志物CD31，分化形成大量篩狀排列的窗孔結構，利于肝細胞與血液之間進行活躍的物質交換。肝纖維化時，肝竇微環境發生改變，LSEC發生去分化(失去窗孔結構，重新表達連續性內皮標志物CD31)，內皮下形成連續性基底膜，從而使肝竇出現了毛細血管化的血管結構—肝竇毛細血管化。因此，連續性血管內皮標志物表達增加是肝臟大血管和肝竇發生血管新生的共同表征。實驗中我們看到DMN誘導的肝纖維化模型小鼠肝血管成像紋理粗糙、血管分支及微血管數增多、走形紊亂，且肝組織連續性血管內皮標志物CD31表達增加，而扶正化瘀組分復方具有改善肝血管紋理、減少CD31表達的作用。從血管新生的發生機理上看，肝竇內皮細胞是肝臟血管新生的重要細胞學基礎，而VEGF信號通路是促血管新生的重要分子病理機制。肝纖維化時肝竇內皮細胞發生表型改變，CD31表達增加，同時針對肝纖維化缺血缺氧環境，各種促血管生成因子如VEGF、Angiopoietin-1、PDGF等釋放增加[16]。VEGF與其受體VEGFR2結合，通過絲裂原活化蛋白激酶/胞外信號調節激酶信號途徑，促進血管新生和纖維化[17]。

本動物實驗結果表明，扶正化瘀組分復方具有抗DMN小鼠肝纖維化的作用，其機制與抑制肝血管新生有關。與扶正化瘀全方相比療效相當，也一定程度證實了“組分復方源于原方、成分明確、療效又可等同原方甚至高于原方”這一研究思路的可行性。

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(2014-12-26收稿 責任編輯：洪志強)

Fuzheng Huayu components formula exerted anti-liver fibrosis through inhibiting angiogenesis

Lyu Jing1，Tan Ye2，Zhao Zhimin3，Huang Kai3，Shen Li2，Tao Yanyan2，Liu Ping2，Liu Chenghai2,3,4,5

(1Departmentoflivercirrhosis,ShuguangHospitalAffiliatedtoShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China; 2InstituteofLiverDiseases,ShuguangHospitalAffiliatedtoShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China; 3ShanghaiKeyLaboratoryofTraditionalChineseClinicalMedicine(14ZD2273200),Shanghai201203,China; 4E-instituteofShanghaiMunicipalEducationCommittee,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China，Shanghai2012; 5KeyLaboratoryofLiverandKidneyDiseases(ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine),MinistryofEducation,Shanghai201203,China)

Objective: The purpose of this study is to investigate the mechanism of Fuzheng Huayu Components formula against Liver Fibrosis relating to Angiogenesis. Methods: Using DMN-induced liver fibrosis model in mice,Fuzheng Huayu formula as positive control. Liver fibrosis was estimated by Sirius red staining and hydroxyproline content assay. Liver angiogenesis was evaluated by liver tissue microvascular imaging analysis and MVD labeled by CD31. VEGF-R2 expression was observed by western blot. Zebrafish functional intersegmental vessels count and alkaline phosphatase activity was to investigate angiogenesis. Results: Fuzheng Huayu Components formula can alleviate liver function in DMN mice (P<0.01).Liver collagen deposition and hydroxyproline content were reduced significantly (P<0.01). The hepatic microvasculature reduced(P<0.01) with the VEGFR2 protein expression down regulated accordingly(P<0.01). It also inhibited alkaline phosphatase activity in zebrafish. Conclusion: Fuzheng Huayu Components formula inhibited liver fibrosis in DMN-treated mice. It's mechanism may be related to inhibit angiogenesis.

Liver fibrosis; Angiogenesis; Fuzheng Huayu Components formula

國家自然科學基金項目(編號：81173405)；上海市醫學領軍人才計劃(編號：LJ10005)；上海中醫藥大學預算內項目(編號：2014YSN40)

R575.2

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.02.009