自擬益腎湯對早期糖尿病腎病患者尿白蛋白的影響及部分機(jī)制探討

苗 楊

(四川省成都市新都區(qū)中醫(yī)醫(yī)院急診科，成都，610500)

自擬益腎湯對早期糖尿病腎病患者尿白蛋白的影響及部分機(jī)制探討

苗 楊

(四川省成都市新都區(qū)中醫(yī)醫(yī)院急診科，成都，610500)

目的：觀察自擬益腎湯對早期糖尿病腎病尿白蛋白的臨床療效及部分作用機(jī)制。方法：將本院收治的60例2型糖尿病腎病患者根據(jù)隨機(jī)方法分為對照組(30例)和觀察組(30例)，2組患者均接受健康教育、合理飲食指導(dǎo)，內(nèi)科降糖治療，常規(guī)口服纈沙坦，80 mg/d；合并高脂血癥者加服辛伐他汀，20 mg/d。觀察組在上述常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用自擬益腎湯，水煎藥方200 mL，1劑/d(早晚分服)，連用12周,1個(gè)療程結(jié)束后觀察2組患者治療前后24 h尿微量白蛋白定量、糖化血紅蛋白(HbAlc)、空腹血糖(FGC)、餐后2 h血糖(2 h BG)的變化；以及血清中PI3K、Akt、p-Akt、bad、p-bad、Bcl-2，Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果：1)2組治療后24 h尿微量白蛋白定量、FPG、OGTT均較治療前降低，與對照組比較，觀察組降低的程度較為明顯(P<0.05)；2)2組治療后血清中PI3K、p-Akt、p-bad、Bcl-2的蛋白表達(dá)均較治療前升高，Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)較治療前降低，與對照組比較，觀察組改變的幅度比較明顯(P<0.05)。結(jié)論：自擬益腎湯具有明顯地降低糖尿病腎病蛋白尿作用，其機(jī)制可能與PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。

糖尿病腎病；早期；尿白蛋白；自擬益腎湯；PI3K/AKT信號(hào)通路；細(xì)胞凋亡

糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy，DN)是糖尿病最常見的并發(fā)癥，其屬于糖尿病周身性微血管病變的病變類型之一。DN早期以尿蛋白為主要表現(xiàn)，隨著腎功能漸進(jìn)性損害，晚期出現(xiàn)嚴(yán)重腎功能衰竭，導(dǎo)致了糖尿病患者的死亡。隨著現(xiàn)代生活飲食結(jié)構(gòu)的不斷變化，糖尿病的發(fā)病率逐年上調(diào)，隨之導(dǎo)致DN的發(fā)病率亦上升，具最新調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)據(jù)最新統(tǒng)計(jì)[1]，我國目前約有5 000萬人正面臨著糖尿病的威脅。DN的發(fā)生是一個(gè)緩慢的漸進(jìn)過程，腎功能的早期損害存在可逆性，故早期診斷DN具有重要的臨床意義。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為DN屬于“消渴”“水腫”“脹滿”“關(guān)格”等范疇，臟氣虛衰、瘀血阻滯、水濕內(nèi)停是其主要病機(jī)。由于各類西藥都可能產(chǎn)生不同程度的不良反應(yīng)，DN患者較難耐受。所以，探尋更安全有效的DN癥治療方案尤其重要，中藥湯藥的治療價(jià)值逐漸受到重視。

PI3K/AKT盡管目前研究人員對DN的發(fā)病機(jī)制仍處于不斷探索中，但有證據(jù)顯示細(xì)胞的凋亡在DN的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，PI3K/AKT是目前證實(shí)在在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中發(fā)揮重要作用的信號(hào)通路[2-4]。本研究通過檢測患者血清中PI3K/AKT信號(hào)通路標(biāo)志性因子的表達(dá)變化，以探討自擬益腎湯治療DN的機(jī)制，以豐富治療疾病的理論，為同類研究提供可靠的理論依據(jù)。具體情況如下：

1 資料和方法

1.1 一般資料 研究對象為本院2010年3月至2013年3月收治的60例早期DN患者，所有患者診斷均符合2010年中華醫(yī)學(xué)會(huì)頒布的《中醫(yī)內(nèi)科常見病診療指南》中關(guān)于DN的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。將60例患者根據(jù)隨機(jī)方法分為對照組和觀察組，觀察組30例，其中男性18例，女性12例，年齡31～58歲，平均(42.5±4.4)歲，肥胖10例，原發(fā)性高血壓9例，高脂血癥7例；對照組30例，其中男性17例，女性12例，年齡30～57歲，平均(43.9±3.9)歲，肥胖11例，原發(fā)性高血壓8例，高脂血癥8例。2組患者在年齡分布、性別、并發(fā)癥等一般臨床資料無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具可比性。

1.2 病例納入標(biāo)準(zhǔn) 1)尿蛋白的排泄率(ARE)在20～200 ms/min，即尿微量白蛋白陽性，而尿常規(guī)蛋白的測定陰性;2)無嚴(yán)重肝臟、腎臟、或心功能異常者；3)惡性腫瘤及重癥感染患者；4)均簽署知情同意書。

1.3 病例排除標(biāo)準(zhǔn)[7]具備以下任何一條的患者均被排除本研究：1)合并心、腦、腎等重大臟器疾病患者；2)合并活動(dòng)性肝炎或者肝臟疾病患者；3)妊娠期、哺乳期婦女；4)精神異常/認(rèn)知功能障礙患者；5)不予簽署知情同意書患者。

1.4 治療方法 2組患者均接受健康教育、合理飲食指導(dǎo)，內(nèi)科降糖治療，常規(guī)口服纈沙坦(代文，北京諾華制藥有限公司，國藥準(zhǔn)H20091011)，80 mg/d；合并高脂血癥者加服辛伐他汀(京必舒新批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字H20000009)，20 mg/d。觀察組在上述常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用自擬益腎湯，具體方藥如下：知母12 g,黃柏9 g,生地黃9 g,丹參12 g,田七12 g,紅花9 g,女貞子9 g,墨旱蓮9 g,補(bǔ)骨脂12 g,龜甲15 g,吳茱萸12 g,菟絲子9 g,黃芪30 g,桑螵蛸9 g，水煎藥方200 mL，1劑/d(早晚分服)。2組均以12周為1個(gè)療程。

1.5 檢測方法 研究對象空腹，無菌情況下用無肝素真空采血管采集肘靜脈血5 mL，1 h內(nèi)，用3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，分離并吸取上層血清，溶血樣本棄用，即刻檢測或4 ℃保存3 d內(nèi)檢測。檢測前樣本恢復(fù)至室溫，不可反復(fù)復(fù)溫。ELISA法試劑盒由廣州達(dá)安基因股份有限公司提供，酶標(biāo)儀、洗板機(jī)由上海滬峰生物科技有限公司提供。根據(jù)說明書進(jìn)行上樣、孵育、洗滌、加酶標(biāo)抗體、顯色、數(shù)據(jù)讀取、統(tǒng)計(jì)分析。在ELISA檢測儀上，于450 nm(若以ABTS顯色，則410 nm)處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。操作方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.6 觀察指標(biāo) 1)治療前后患者24 h尿微量白蛋白定量、糖化血紅蛋白(HbAlc)、空腹血糖(FGC)、餐后2 h血糖(2 h BG)的變化；2)血清中PI3K、Akt、p-Akt、bad、p-bad、Bcl-2，Bax蛋白表達(dá)水平的變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料采用(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。使用方差分析或非參數(shù)檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料使用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組臨床療效比較 2組患者治療前24 h尿微量白蛋白定量、HbAlc、FGC、2 hBG比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，2組治療后24 h尿微量白蛋白定量、FPG、OGTT均較治療前降低，與對照組比較，觀察組降低的程度較為明顯(P<0.05)；具體見表1。

2.2 2組PI3K/AKT信號(hào)通路標(biāo)志因子的改變 2組治療后血清中PI3K、p-Akt、p-bad、Bcl-2的蛋白表達(dá)均較治療前升高，Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)較治療前降低，與對照組比較，觀察組改變的幅度比較明顯(P<0.05)。具體見表2。

表1 2組臨床療效比較

注：與治療前相比，*P<0.05；與對照組相比，△P<0.05。

表2 2組指標(biāo)變化比較

注：與治療前相比，*P<0.05；與對照組相比，△P<0.05。

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為DN屬于屬于“消渴”“水腫”“脹滿”“關(guān)格”等范疇，臟氣虛衰、瘀血阻滯、水濕內(nèi)停是其主要病機(jī)。本研究使用自擬益腎湯中知母、黃柏具有滋陰清虛熱作用，方中補(bǔ)骨脂、菟絲子、桑螵蛸共奏溫腎助陽、補(bǔ)腎固攝之功，生地黃、龜甲、女貞子聯(lián)合使用可以達(dá)到益精填髓的目的，血瘀是貫穿于DN疾病全過程，本方加用丹參、紅花以活血化瘀通絡(luò)，本研究重用黃芪，黃芪性味甘溫，具有補(bǔ)氣固表，利尿托毒的功效，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、保肝、利尿、抗衰老、抗應(yīng)激、降壓和較廣泛的抗菌作用。臨床藥物動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)使用黃芪提取物灌胃后，DN大鼠出現(xiàn)血清總蛋白、白蛋白增加，尿量增加的特征。同時(shí)發(fā)現(xiàn)大鼠的免疫反應(yīng)能力增強(qiáng)，尿蛋白逆轉(zhuǎn)，腎臟纖維化進(jìn)程變慢[6]。

腎小球是DN最早損害的部位，正常生理狀態(tài)下，白蛋白在近曲小管被完全吸收，受損的腎小球?qū)е缕錇V過膜通透率增高，蛋白質(zhì)的濾過率超過了吸收率，出現(xiàn)蛋白尿，故尿微量白蛋白是DN早期信號(hào)，同時(shí)結(jié)合患者的病史、癥狀即可較為準(zhǔn)確的判斷病情，研究腎臟進(jìn)入纖維化階段的進(jìn)程[7-8]。故本研究選用24 h尿微量白蛋白作為臨床檢測指標(biāo)，結(jié)果顯示2組患者的24 h尿微量白蛋白均較正常群體升高，經(jīng)過治療后均有所改善，但是加用自擬益腎湯的觀察組患者降低24 h尿微量白蛋白的幅度明顯高于對照組，提示自擬益腎湯具有理想的保護(hù)腎臟功能。

近年來關(guān)于細(xì)胞凋亡在多種內(nèi)科疾病中的作用逐漸受到重視，諸多文獻(xiàn)證實(shí)細(xì)胞凋亡在DN發(fā)生發(fā)展過程中占據(jù)重要位置。PI3K激活后可磷酸化細(xì)胞膜上的肌醇，產(chǎn)生第二信使PIP3，PIP3通過與Akt的PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合，不僅促使Akt從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)位，還可導(dǎo)致使其構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而使Akt的Ser473和Thr308位點(diǎn)磷酸化而被激活。Akt又名蛋白激B(PKB)，是分子量約為60 kD的絲/蘇氨酸蛋白激酶，是重要的抗凋亡調(diào)節(jié)因子。PI3K激活的Akt可以通過磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白Bad、Caspase 9、NF-κB、Forkhead、mTOR、Par-4、P21等，從而介導(dǎo)多種生物學(xué)效應(yīng)，如：介導(dǎo)胰島素、多種生長因子誘發(fā)的細(xì)胞生長,經(jīng)多種途徑促進(jìn)細(xì)胞存活,是重要的抗凋亡調(diào)節(jié)因子[9-11]。Bad是首個(gè)發(fā)現(xiàn)作為Akt作用底物的Bc1-2家族促凋亡蛋白，Akt能磷酸化Bad后，抑制Bad促凋亡作用，而促進(jìn)解離的Bcl-2和Bcl-xL發(fā)揮抗凋亡作用。當(dāng)用特異的PI3K抑制劑Wortmannin或LY294002處理后,Akt引起的Bad磷酸化(Ser136)受阻[12-15]。此外，Akt也能磷酸化Bcl-2家族成員Bax的Ser184位點(diǎn),阻止其自身形成二聚體,負(fù)調(diào)控促凋亡功能。Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中Caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子。Caspase-3正常以無活性的酶原形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被凋亡信號(hào)激活，活化的Caspase-3由兩個(gè)大亞和兩個(gè)小亞基組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，但在細(xì)胞凋亡的晚期和死亡細(xì)胞，Caspase-3的活性明顯下降。具有活性的Caspase-3是多條凋亡通路的聯(lián)系因子，對參與凋亡所必須的蛋白產(chǎn)生直接或間接地酶解作用，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示2組治療后血清中PI3K、p-Akt、p-bad、Bcl-2的蛋白表達(dá)均較治療前升高，Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)較治療前降低，與對照組比較，干預(yù)后使用自擬益腎湯的觀察組改變的幅度比較明顯(P<0.05)，這一結(jié)果與國內(nèi)外諸多文獻(xiàn)數(shù)據(jù)相符合。可見，DN的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，抑制細(xì)胞凋亡已經(jīng)成為治療DN的研究靶向。

本研究不僅證實(shí)了自擬益腎湯具有護(hù)腎作用，同時(shí)進(jìn)一步證該藥方可以抑制細(xì)胞凋亡，故推測自擬益腎湯治療DN可能與抑制凋亡過程有關(guān)。

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(2014-06-16收稿 責(zé)任編輯：徐穎)

Impact of Self-made Kidney Tonifying Decoction on Urinary Albumin in Patients with Early Diabetic Nephropathy and Discussion on Its Partial Mechanism

Miao Yang

(EmergencyDepartment,ChineseMedicineHospitalofXinduDistrict,Chengdu610500,China)

Objective: To observe clinical effects of self-made kidney tonifying decoction on urinary albumin in patients with early Diabetic Nephropathy and to explore its partial mechanism.Methods: Sixty patients with type 2 diabetic nephropathy admitted at our hospital were randomly divided into control group (n=30) and observation group (n=30),and patients in both groups were given health education,diet instruction,internal medicine hypoglycemic therapy,80 mg/day of conventional oral valsartan.Those who also had hyperlipidemia were given extra treatment of simvastatin,20 mg/day.Observation group also applied the self-made kidney tonifying decoction based on the conventional treatment,200 ml water tisanes,1 agent daily in the morning and evening,for 12 continuous weeks.After a period of treatment,24h microal buminuria quantitative determination,glycosylated hemoglobin (HbAlc),fasting blood-glucose (FGC),2 h postprandial blood glucose (2 HBG) changes of patients of the two groups before and after treatment were recorded; and protein expression level changes of serum PI3K,Akt,p - Akt,bad,p - bad,Bcl 2,Bax and Caspase 3 were measured.Results: 1) The levels of 24h microalbuminuria quantitative determination,FPG,OGTT after treatment were reduced compared to those before treatment in both groups,and the reduction extent of observation group were more obvious compared with those of the control group (P<0.05); 2) the levels of serum PI3K,p-Akt,p-bad,the Bcl-2 protein expression in the two groups after treatment were increased compared to those before treatment,and the Bax,Caspase 3 protein expression was reduced,the change magnitude of observation group were more obvious compared with those of the control group (P<0.05).Conclusion: Self-made kidney tonifying decoction has obvious effect to reduce proteinuria of diabetic nephropathy,and its mechanism may be associated with PI3K/Akt signal transduction pathway.

Diabetic Nephropathy; Early stage; Urinary albumin; Self-made kidney tonifying decoction; PI3K/AKT signaling pathway; Cell apoptosis

重慶市衛(wèi)生局中醫(yī)處項(xiàng)目(編號(hào)：2012-1-6)

R285.6;R587.2

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.02.017