齊墩果酸誘導多種小鼠胚胎干細胞向生殖細胞方向分化研究

萬 謙 姚奏英 伍林濤 陸 華

(1 成都中醫藥大學第二附屬醫院，成都，610041; 2 四川省計劃生育研究所，成都，610041; 3 成都中醫藥大學臨床醫學院，成都，610075; 4 貴州省油菜研究所，貴陽，550008)

齊墩果酸誘導多種小鼠胚胎干細胞向生殖細胞方向分化研究

萬 謙1，2姚奏英2，3伍林濤4陸 華1，2

(1 成都中醫藥大學第二附屬醫院，成都，610041; 2 四川省計劃生育研究所，成都，610041; 3 成都中醫藥大學臨床醫學院，成都，610075; 4 貴州省油菜研究所，貴陽，550008)

目的：尋找一種能誘導多種胚胎干細胞向生殖細胞方向分化的化合物，并以常用的誘導物維甲酸(Retinoic Acid,RA)作為陽性參照物。方法：分別培養小鼠胚胎干細胞1B10、D3、R1/E，誘導它們形成擬胚體，讓擬胚體貼壁生長，加入特定化合物誘導貼壁細胞分化，誘導72 h后，提取被誘導細胞的RNA，再合成cDNA，最后利用實時熒光定量PCR檢測各被誘導細胞中與生殖分化相關的基因的表達水平的變化。結果：發現齊墩果酸(Oleanolic Acid，OA)顯著上調了所有被研究的小鼠胚胎干細胞的生殖分化關鍵基因的表達水平，同時發現陽性參照物RA僅能誘導1B10、R1/E，而不能誘導D3向生殖細胞方向分化。結論：OA能誘導多種胚胎干細胞向生殖細胞方向分化，誘導能力方面具有比常用誘導物維甲酸更廣泛的普遍性。

齊墩果酸;小鼠胚胎干細胞;體外分化誘導物;生殖方向分化

胚胎干細胞來源于胚胎在囊胚時期的囊胚中的內細胞團，被發現具有強大的分化能力，在體外能被特定的化合物或者蛋白質因子誘導分化為多種細胞，比如心肌細胞[1]、表皮細胞[2]、血管細胞[3]、角化細胞[4]、神經細胞[5]、生殖細胞[6]等等。目前，體外誘導系統被廣泛地采用來研究胚胎干細胞的分化，現已有多種誘導物被發現，包括PDGF，BMP2，BMP4，Activin A，bFGF，Wnt3a，RA，FGF，DMSO，and TGF-b1[7-9]。

近年來，新的誘導物或者誘導方法頻繁被發現，使得胚胎干細胞的體外誘導系統不斷被充實，說明體外誘導系統有廣泛的空間可以被挖掘。很多中藥單體被發現具有令人感興趣的功能，所以，我們希望從中藥單體中尋找新的可誘導胚胎干細胞向生殖細胞分化的物質。另一方面，目前被研究的胚胎干細胞有多種細胞株，拿小鼠胚胎干細胞來說，就有1B10、D3、R1/E、CE3、J1等，這些細胞株雖然都來自于囊胚的內細胞團，但是其遺傳背景是有差別的，同一種誘導物能否誘導多種胚胎干細胞的定向分化的較系統的考察未見報道，所以，我們也希望考察新發現的誘導物和常用誘導物RA在誘導能力方面的普遍性。

本研究中，我們首先發現了OA能誘導1B10的生殖分化，同時發現RA有類似作用，接著我們考察了誘導能力的普遍性，發現：OA能誘導1B10、D3、R1/E的生殖分化，而RA僅能誘導1B10、R1/E的生殖分化，不能誘導D3的生殖分化。

綜上所述，本研究一方面充實了體外誘導系統的內容，另一方面首次較系統地考察了一種誘導物誘導能力的普遍性。

1 材料

1.1 細胞株 1B10細胞株為四川大學劉聰老師饋贈，D3、R1/E細胞株購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 藥品和試劑 OA為成都中醫藥大學藥學院制備，純度98%，RA購買自Sigma公司，貨號：R2625，純度98%，OA和RA的原液濃度都為3 mg/mL，溶劑都為DMSO；DMEM高糖培養液、胎牛血清(FBS)、細胞培養用雙抗(青霉素和鏈霉素)、磷酸緩沖液(PBS)、細胞消化用胰蛋白酶均購自成都哈里公司，批號分別為20130401、20130405、20130315、20130505、20130408；非必需氨基酸(NEAA)，美國Gibco公司，批號：03985 K11；β-巰基乙醇(β-ME)，美國Gibco公司，批號：862986；白血病抑制因子(LIF)，美國Millipore公司，批號：1993949。普通細胞6孔培養板和超低吸附培養6孔板購自美國Corning公司，批號分別為04718601、10312041；RNA提取試劑盒Tri Reagent，美國Molecular Research Center公司，批號：4071；反轉錄試劑盒iSCRIPT cDNA SYNTHES，美國Bio-Rad公司，批號：T730001972；cDNA合成試劑盒iQ SYBR GRN，美國Bio-Rad公司，批號：T760000082。

1.3 儀器 UPR-I-10T純水機(中國優普公司)；3111型CO2細胞培養箱(美國Thermo Scientific公司)；SW-CJ-2FD超凈工作臺(中國蘇州凈化公司)；TDL-40B型大體積離心機(中國Anke公司)；Legend Micro 17R型高速臺式冷凍離心機(美國Thermo公司)；DMI3000B型倒置顯微鏡(德國Leica公司)；CFX96型定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 小鼠胚胎干細胞的培養 培養小鼠胚胎干細胞的飼養層細胞使用小鼠胚胎成纖維細胞NIH3T3。培養NIH3T3的培養液為DMEM高糖培養液，其中含10% FBS、100 U/mL盤尼西林、0.1 mg/mL鏈霉素。培養小鼠胚胎干細胞的培養液為DMEM高糖培養液，其中含17% FBS、100 U/mL盤尼西林、0.1 mg/mL鏈霉素、0.1 mmol/L的NEAA、0.1 mmol/L的β-ME和1 000 U/mL LIF。待培養孔中的NIH3T3生長到90%匯合度時，加入絲裂霉素C至終濃度為10 μg/mL，將培養板放入細胞培養箱中孵育3 h，而后用無菌PBS清洗細胞5遍。在培養孔中加入適量的小鼠胚胎干細胞的培養液，將相應的小鼠胚胎干細胞接種至培養孔，每天更換培養小鼠胚胎干細胞的培養液，4～7 d后，可見干細胞克隆出現。

2.2 擬胚體(EB)的誘導形成 誘導EB形成的培養液與培養小鼠胚胎干細胞的培養液成分一樣，只是沒有LIF。EB形成的操作程序如下：往培養孔中加入細胞消化用胰蛋白酶；將培養板放入細胞培養箱中消化3 min；吹打消化下來的細胞至細胞呈單細胞狀態；細胞混合液放入細胞培養箱中靜置30 min，以利用差速貼壁法分離飼養層細胞NIH3T3和小鼠胚胎干細胞；收集混合液靜置后的上清液(大部分懸浮細胞為小鼠胚胎干細胞)，移入超低吸附培養板；24 h后，可觀察到懸浮的類圓形的EB形成，再過24 h，收集所有EB待用。

2.3 相關化合物對小鼠胚胎干細胞形成的EB的干預 將收集得到的EB移入普通細胞培養板。24 h內EB貼壁并生長。24 h后，對相應的培養孔中分別加入RA和OA，終濃度都為3.0 μg/mL，同時設DMSO溶劑對照，干預72 h后。

2.4 實時熒光定量PCR分析(qPCR) 貼壁的EB被干預72 h后，利用RNA提取試劑盒Tri Reagent提取各孔的總RNA，而后以提取的RNA為模板利用cDNA合成試劑盒合成cDNA，最后以cDNA為模板利用Sybr Green Qpcr試劑盒進行qPCR分析，目標基因為11種與生殖分化相關的基因，分析中以β-actin為內參基因，具體基因名稱和各引物序列,見表1。表1所列基因的功能可描述如下：Oct-4對于保持干細胞的多能性很重要，過低或者過高的Oct-4將導致干細胞分化[10]；GDF-9是向雌性生殖細胞分化的早期標記基因[11]；Stra8是向雄性生殖細胞分化的早期標記基因[12]；SCP3是減數分裂的早期標記基因[13]；Mvh是向雌性生殖細胞和雄性生殖細胞分化的早期標記基因[14]；ZP1，ZP2，and ZP3是卵子細胞形成的標記基因[15]；Itga6，Itgb1，and TP2是精子細胞形成的標記基因[16-17]；β-Actin被做為qPCR檢測的內參基因。

表1 qPCR分析中的相關基因名稱及引物序列

2.5 統計學處理 利用SPSS 13.0軟件進行統計學分析，各干預組的數據與相應的DMSO溶劑對照的數據進行比較，比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05被認為有統計學意義。

3 結果

3.1 RA能誘導1B10、R1/E，同時不能誘導D3向生殖細胞方向分化 對于1B10，RA顯著上調了GDF-9、Stra8、Mvh、ZP2、ZP3、TP2，非顯著上調了Itga6、Itgb1，顯著下調了Oct-4，非顯著下調了SCP3、ZP1，小結起來：RA能啟動1B10向雌性生殖細胞和雄性生殖細胞方向的分化；對于D3，RA顯著上調了Stra8，顯著下調了Oct-4、GDF-9、SCP3、Mvh、ZP3、Itga6、Itgb1、TP2，非顯著下調了ZP1、ZP2，小結起來：RA不能啟動D3向雌性生殖細胞和雄性生殖細胞方向的分化；對于R1/E，RA顯著上調了GDF-9、Stra8、SCP3、Mvh、ZP1、ZP2、ZP3，非顯著上調了TP2，顯著下調了Oct-4，Itga6、Itgb1，非顯著下調了Oct-4，小結起來：RA能啟動R1/E向雌性生殖細胞方向的分化，不能誘導R1/E向雄性生殖細胞方向的分化。綜上所述：RA能誘導1B10、R1/E，同時不能誘導D3向生殖細胞方向分化。見圖1。

圖1 RA對不同小鼠胚胎干細胞的11種與生殖分化 相關基因表達的影響 A：1B10；B：D3；C：R1/E

3.2 齊墩果酸能誘導1B10、R1/E、D3向生殖細胞方向分化 對于1B10，OA顯著上調了GDF-9、Stra8、Mvh、ZP2、ZP3、TP2，非顯著上調了Oct-4、Itga6、Itgb1，非顯著下調了SCP3、ZP1，小結起來：OA能啟動1B10向雌性生殖細胞和雄性生殖細胞方向的分化；對于D3，OA顯著上調了GDF-9、Mvh、ZP3、Itga6、Itgb1、TP2，非顯著上調了Oct-4、SCP3、ZP1，非顯著下調了Stra8、ZP2，小結起來：OA能啟動D3向雌性生殖細胞和雄性生殖細胞方向的分化；對于R1/E，OA顯著上調了Stra8、SCP3、Mvh、ZP1、ZP2、Itga6、Itgb1、TP2，非顯著上調了Oct-4、GDF-9、ZP3，小結起來：OA能啟動R1/E向雌性生殖細胞和雄性生殖細胞方向的分化。綜上所述：OA能誘導1B10、D3、R1/E向生殖細胞方向分化，見圖2。

圖2 OA對不同小鼠胚胎干細胞的11種與生殖分化 相關基因表達的影響 A：1B10；B：D3；C：R1/E

4 討論

本研究發現了OA能誘導1B10、D3、R1/E等多種小鼠胚胎干細胞向生殖細胞方向分化，而研究中作為陽性藥物對照的RA僅能誘導1B10和R1/E，不能誘導D3向生殖細胞方向分化，而且對于R1/E，RA僅能誘導其向雌性生殖細胞分化，不能誘導其向雄性生殖細胞分化。

小鼠胚胎干細胞1B10是E14TG2a(ATCC No.:CRL-1821)的亞克隆，其最終來源于129/Ola小鼠系，同時，當其被注射進入囊胚后，將形成生殖細胞[18]。小鼠胚胎干細胞R1/E(ATCC No.:SCRC-1036)來源于129X1×129S1系的雄性的3.5 d的囊胚，同時，其具有形成生殖細胞的能力[19]。小鼠胚胎干細胞D3(ATCC No.:CRL-11632)來源于129/Sv+c/+p系的3.5 d的囊胚，同時，當其被注射進入囊胚后，將形成生殖細胞[20]。綜上所述，從ATCC的描述上，3種小鼠胚胎干細胞雖然來源有一些差別，但是都具有分化為生殖細胞的潛能，尚不能看出上述3種小鼠胚胎干細胞在成為生殖細胞方面的重大差別，所以RA和OA在誘導它們向生殖細胞分化的能力差別，更有可能是源自于RA和OA誘導潛能方面的差別。

RA和OA功能上的差別最終源自于結構上的差別。RA是維生素A的衍生物，是目前獲得公認的胚胎干細胞的生殖分化誘導物[21]。OA為五環三萜類化合物，以游離或結合成苷的形式存在于白花蛇舌草、山楂、丁香、大棗、女貞子、枇杷葉、橡木及夏枯草等植物中[22]。OA有保肝、降糖、抗HIV和抗腫瘤等作用[23]。OA是補腎中藥女貞子的主要有效成分之一[24]，較新的研究表明OA也具有調節中醫藥概念“腎精”的功能[25]。圖3和圖4展示了OA和RA的結構，可見兩者結構差異較大，反映在誘導能力上OA強于RA。進一步的研究將探索OA類似物的誘導能力。

圖3 齊墩果酸(OA)的結構圖

圖4 維甲酸(RA)的結構圖

綜上所述，在誘導小鼠胚胎干細胞向生殖細胞分化方面，OA比RA具有更廣闊的適用對象。此研究結果不僅拓寬了外源的生殖分化誘導物的范圍，也完成了較系統評估某種化合物誘導生殖分化能力的首次報道。本研究具有一定的創新性和一定的潛在實用性。

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[20][EB/OL].https://www.atcc.org/Products/All/CRL-11632.aspx?slp=1#generalinformation，2014-5-26.[21]Chen W，Jia W，Wang K，et al.Retinoic acid regulates germ cell differentiation in mouse embryonic stem cells through a Smad-dependent pathway[J].Biochem Biophys Res Commun,2012，418(3):571-577.

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(2014-05-30收稿 責任編輯：徐穎)

Study on Oleanolic Acid Inducing Several Strains of Mouse Embryonic Stem Cells to Differentiation towards Germ Cells

Wan Qian1,2，Yao Zouying2,3，Wu Lintao4，Lu Hua1,2

(1TheSecondAffiliatedHospital,ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu610041,China; 2SichuanFamilyPlanningResearchInstitute,Chengdu610041,China; 3TheAffiliatedCollegeofMedicalSciences,ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu610075,China; 4GuizhouRapeInstitute,Guiyang550008,China)

Objective:To find an agent which can induce several strains of embryonic stem cells to differentiate towards germ cells,with the common inducer retinoic acid (RA) as positive control.Methods:Different strains of mouse embryonic stem cells (mESC) 1B10,D3,R1/E were respectively cultured,and induced to form embryoid bodies (EBs) which were allowed to attach; different compounds were then added to intervene the attached cells; the intervene continued for 72 h and RNA were extracted and cDNA were synthesized; finally,real-time fluorescence quantitative PCR (qPCR) assay were used to measure the transcriptional expression patterns of 11 reproductive differentiation related genes.Results:It was found that oleanolic acid (OA) can induce all 3 strains of mouse mESC to differentiate towards germ cells and the positive control RA can only induce mESC-1B10 and mESC-R1/E to differentiate towards germ cells.RA cannot induce mESC-D3 to differentiate towards germ cells.Conclusion:OA can induce several strains of embryonic stem cells to differentiate towards germ cells and it has broader universality than the positive control RA.

Oleanolic acid; Mouse embryonic stem cells; In vitro differentiation inducer; Differentiation towards germ cells

國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)“從不孕不育探討“腎主生殖”理論的研究”的相關研究(編號：2010CB530403)；成都中醫藥大學實驗技術項目(編號：063003)；成都中醫藥大學校基金(編號：ZRMS201248)
姚奏英為本文并列第一作者

R285.6

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.02.021