血必凈注射液干預(yù)甲型H1N1流感重癥肺炎小鼠的療效及機制研究

馬月霞 郭亞麗 劉 建 王玉光

(1 北京市懷柔區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，北京，101400； 2 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京，100010)

血必凈注射液干預(yù)甲型H1N1流感重癥肺炎小鼠的療效及機制研究

馬月霞1，2郭亞麗2劉 建2王玉光2

(1 北京市懷柔區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，北京，101400； 2 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京，100010)

目的：觀察血必凈注射液(血必凈)治療甲型H1N1流感重癥肺炎小鼠的療效，并初步研究其作用機制。方法：C57BL/6小鼠隨機分為正常組、模型組、血必凈組，正常組小鼠予20 μL PBS滴鼻，模型組小鼠2×105TCID50/20 μL甲型H1N1流感病毒液滴鼻感染，建立流感重癥肺炎小鼠模型。血必凈組小鼠2×105TCID50/20 μL甲型H1N1流感病毒液滴鼻感染，并于感染前24 h腹腔注射給藥，1次/d，連續(xù)給藥5 d。通過觀察、檢測不同時間點各組小鼠的存活率、體重、肺病毒載量、肺濕干比、肺組織病理、肺灌洗液細胞因子等結(jié)果，評價血必凈干預(yù)小鼠流感重癥肺炎的療效，初步探討其作用機制。結(jié)果：模型組小鼠存活率為30%，體重下降明顯，肺濕干比明顯高于正常組(P<0.05)，提示嚴重肺水腫；肺組織病理顯示，雙肺彌漫性炎性反應(yīng)細胞浸潤，肺泡上皮細胞脫落、壞死，支氣管上皮細胞變性，伴有水腫、瘀血、出血，提示流感重癥肺炎模型成立。血必凈組小鼠存活率為60%，較模型組為優(yōu)，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，體重下降較模型組輕，肺濕干比較模型組降低，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；肺組織病理示炎癥細胞浸潤，肺臟水腫，淤血、出血等嚴重程度均較模型組輕，提示血必凈可減輕甲型流感重癥肺炎小鼠的肺損傷。模型組與血必凈組肺病毒載量無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示血必凈并無抑制病毒復(fù)制的作用。血必凈組可于感染后1 d、3 d降低TNF-α水平(P<0.05)，于感染后3 d降低IL-6水平(P<0.05)。結(jié)論：血必凈對流感重癥肺炎小鼠有減輕肺損傷及死亡保護趨勢，但作用不顯著，這可能與血必凈并無直接抗病毒，但能調(diào)節(jié)感染早期TNF-α、IL-6等細胞因子水平的作用有關(guān)。

流感；甲型H1N1；中醫(yī)藥；血必凈注射液

自2009年4月墨西哥首次爆發(fā)H1N1豬流感(the Pandemic H1N1 2009 virus，pH1N1)[1]，全球因感染H1N1豬流感總死亡病例達18449例，其死因主要為重癥肺炎和呼吸窘迫綜合征(ARDS)。因此，積極有效的抗感染、緩解肺炎癥狀成為流感重癥肺炎的治療關(guān)鍵。王今達教授針對重癥感染提出了“菌毒炎并治”理論，其代表藥物血必凈注射液聯(lián)合常規(guī)抗感染方案治療重癥肺炎，臨床研究顯示具有緩解癥狀、縮短病程的療效[2]。我們在本文旨在研究血必凈注射液單用治療小鼠甲型H1N1流感重癥肺炎的效果，并初步探討其作用機制，為血必凈注射液的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 雌性C57BL/6小鼠，體重14～16 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(軍)2012-003。

1.2 病毒 A/Beijing/501/2009(H1N1)流感病毒(簡稱BJ501)，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物與流行病研究所免疫室提供。

1.3 藥品 血必凈注射液(批號：1301201)，規(guī)格為10 mL/支，天津紅日藥業(yè)股份有限公司。

1.4 其余試劑 均購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥品器材供應(yīng)站。

2 方法

2.1 實驗分組 雌性C57BL/6小鼠，體重14～16 g，隨機分為正常組、模型組、血必凈組,其中正常組小鼠在乙醚輕度麻醉后，用20 μL PBS滴鼻，模型組、血必凈組小鼠乙醚輕度麻醉后，2×105TCID50/20 μL病毒液滴鼻感染。血必凈組在造模前24 h開始腹腔注射0.1 mL/d，于感染后第5 d停止給藥；正常組、模型組小鼠均腹腔注射磷酸鹽緩沖液(PBS)0.1 mL/d。

2.2 保護率及體重的測定 每組小鼠10只。從感染日起開始每天準確稱量小鼠體重，觀察一般狀態(tài)，如有無咳嗽、氣促、呼吸困難、煩躁、聳毛等，并記錄小鼠的存活情況，觀察期為14 d。

2.3 肺病毒載量的測定 每組小鼠5只。感染后第4天，摘眼球放血處死小鼠后取出全肺，按肺重(g)∶無血清DMEM(mL)=1∶15的比例，置勻漿機中勻漿，勻漿后置試管中離心(4 ℃，3 000 r/min)15～20 min，去除沉淀，取上清，置-70 ℃冰箱中待用，應(yīng)用CCID50的方法檢測病毒滴度。

2.4 肺濕干比的測定 每組小鼠5只。感染后第5天，處死小鼠后取出全肺，將其分別放在盛有生理鹽水的平皿中清洗2次，用吸水紙吸干表面水分，置于電子稱上稱出肺濕重。將稱量后的鼠肺放于60 ℃的烘箱中，24 h后取出稱肺干重(肺濕干比=肺濕重/肺干重)。肺濕干比是用以反映肺水腫嚴重程度的重要指標。

2.5 肺病理檢測 每組小鼠3只。感染后第5天處死小鼠，取出全肺，盡量避免劃傷肺組織。將肺組織用10%甲醛固定，常規(guī)方法石蠟包埋切片，蘇木素伊紅(HE)染色，光鏡觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)變化。

2.6 TNF-α、IL-6的檢測 分別于感染后6 h、1 d、3 d、5 d、7 d每組各處死5只小鼠，小鼠處死后應(yīng)用滅菌生理鹽水進行支氣管肺泡灌洗(BALF)，每次注入0.6 mL。反復(fù)灌洗5次，回收液注于1.5 mL EP管中，每只小鼠BALF的回收率應(yīng)大于80%。應(yīng)用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)試劑盒檢測回收液中TNF-α、IL-6。

2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 研究數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism5.0(GraphPad Software,SanDiego,CA,USA)軟件進行統(tǒng)計分析，采用t檢驗和方差分析等統(tǒng)計學(xué)方法，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 血必凈對感染H1N1流感病毒的小鼠保護率測定 14 d觀察期結(jié)束時，正常組10只小鼠全部存活。結(jié)果見表1和圖1，模型組小鼠自感染第6 d起開始死亡，觀察期結(jié)束后10只小鼠存活3只，存活率為30%，與正常組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。血必凈組小鼠自感染第7 d起開始死亡，10只小鼠存活6只，存活率為60%，優(yōu)于模型組，但二者無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。由此可見，血必凈對甲型流感重癥肺炎小鼠并無有效的死亡保護作用，但有一定的死亡保護趨勢。

表1 小鼠感染BJ501病毒后的存活情況

注：模型組與正常組比較，*P<0.05；模型組與血必凈組比較，△P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 小鼠感染BJ501病毒后的存活情況

3.2 小鼠體重變化測定 正常組小鼠精神良好，體重穩(wěn)定上升。模型組、血必凈組小鼠均于感染BJ501后第3 d開始精神萎靡，體重大幅下降。血必凈組小鼠狀態(tài)、體重均優(yōu)于模型組，說明血必凈對小鼠有一定的治療作用。結(jié)果見圖2。

圖2 小鼠感染BJ501病毒后各組小鼠體重變化

3.3 小鼠肺部病毒載量的測定 感染后第4 d，處死小鼠，應(yīng)用CCID50的方法檢測小鼠肺部病毒載量。由圖3可見，模型組小鼠肺病毒載量為2.85±0.45 CCID50，血必凈組小鼠肺病毒載量為2.79±0.32 CCID50，模型組與血必凈組病毒載量無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖3 小鼠肺病毒載量

3.4 小鼠肺濕干比的測定 小鼠感染后5 d處死，解剖小鼠并取肺組織，稱量肺濕重，干燥72 h后稱量其干重，計算濕干比，結(jié)果見表2和圖4。模型組與正常組肺濕干具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；血必凈組小鼠肺濕干比低于模型組，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 小鼠感染第5天的肺濕干比

注：模型組與正常組比較，*P<0.05；模型組與血必凈組比較，△P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖4 小鼠感染第5天的肺濕干比

3.5 血必凈注射液對流感病毒感染小鼠肺部病理的影響 感染后第5天,處死3只、解剖小鼠，取肺組織，肺組織經(jīng)4%甲醛固定后，石蠟包埋切片蘇木素伊紅(HE)染色，光鏡觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果由圖5可見，正常組鏡下觀察，組織、細胞結(jié)構(gòu)完整，無炎癥細胞浸潤；模型組鏡下可見彌漫性炎癥細胞浸潤，肺泡上皮細胞脫落、壞死，支氣管上皮細胞變性，伴有水腫、瘀血、出血；血必凈組炎癥細胞浸潤較模型組少，肺泡上皮細胞脫落、壞死，支氣管周圍肺水腫、瘀血和出血程度較模型組輕。

圖5 小鼠感染第5天的肺病理(HE染色，200×)

3.6 TNF-α、IL-6的檢測 感染后6 h、1 d、3 d、5 d、7 d處死小鼠，檢測小鼠BALF中TNF-α、IL-6的含量。由圖6可見，模型組小鼠，TNF-α水平在感染后6 h、1 d、3 d較高，5 d、7 d TNF-α水平下降；IL-6水平自感染后6 h至感染后7 d持續(xù)升高。血必凈組，TNF-α水平在感染后1 d、3 d較模型組持續(xù)下降，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；IL-6水平僅在感染后3 d低于模型組，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。感染后5 d，血必凈停止給藥，TNF-α、IL-6水平回升。

圖6 小鼠BALF中TNF-α、IL-6的含量

4 討論

流行性感冒(簡稱流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，具有傳染性強、發(fā)病率高、死亡率高等特點。其中，住院確診甲流患者[3-4]，影像學(xué)檢查肺炎占40%～66%，而肺炎患者中22.9%～42%可進展為ARDS，是重癥流感的主要死因。重癥流感的發(fā)病機制主要為細胞因子風(fēng)暴導(dǎo)致的免疫失衡[5]，臨床研究顯示，與輕癥流感相比，重癥患者IL-6、IL-8、TNF-α等細胞因子顯著高表達，且與預(yù)后密切相關(guān)[6]。流感屬中醫(yī)“外感熱病”范疇，具有溫?zé)岵⌒再|(zhì)，在發(fā)病過程中有熱邪燔灼、熱迫血溢和耗氣傷津的病理表現(xiàn)，其中，疫毒蘊結(jié)，熱邪煎熬，形成血瘀和瘀血，在重癥患者中表現(xiàn)顯著[7]。臨床觀察表明，早期配合應(yīng)用活血化瘀之品可減少重癥流感患者肺部炎性滲出、出血等，對阻止病灶擴散，加快病灶吸收有重要作用。

血必凈注射液屬活血化瘀類藥，由紅花、赤芍、川芎、丹參、當歸組成，其藥理機制包括抑制中性粒細胞，減少炎癥介質(zhì)的釋放[8-9]；免疫調(diào)節(jié)作用[10]；凝血和抗凝血功能的調(diào)節(jié)[11-12]。臨床上，血必凈注射液聯(lián)合常規(guī)治療早期應(yīng)用對急性呼吸窘迫綜合征及重癥肺炎患者有縮短病程、改善癥狀等保護作用，這可能與血必凈不僅能改善血流灌注狀態(tài)[13-14]，亦能清除過度炎癥相關(guān)因子[15]，從而減輕肺損傷有關(guān)。但血必凈對流感病毒性重癥肺炎的研究較少，其療效和機制均不明確。

本研究結(jié)果顯示，血必凈對流感重癥肺炎小鼠有死亡保護趨勢，且血必凈組小鼠體重優(yōu)于模型組，這與血必凈組小鼠肺水腫、肺病理損傷均輕于模型組的結(jié)果一致。但血必凈組與模型組感染后4 d病毒載量無差異，血必凈組感染后1 d TNF-α的水平，感染后3 d TNF-α、IL-6的水平均低于模型組，由此可見，血必凈可能是通過降低TNF-α、IL-6的水平發(fā)揮間接抗病毒作用，而非直接抑制病毒復(fù)制。本研究首次證實了活血化瘀藥血必凈注射液對流感重癥病毒性肺炎有保護趨勢，且可能通過調(diào)節(jié)不同時間點TNF-α、IL-6等細胞因子的水平而發(fā)揮作用，對臨床重癥流感中醫(yī)辨證治療具有重要的指導(dǎo)意義。

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(2014-11-27收稿 責(zé)任編輯：洪志強)

Study on Treatment of Influenza A H1N1 Induced Severe Pneumonia by Xuebijing Injection

Ma Yuexia1, Shan Minmin1, Guo Yali2, Wang Yuguang2

(1TheTCM.HospitalofBeijingHuairou,Beijing101400,China; 2BeijingHospitalofTraditionalChineseMedicine，CapitalMedicalUniversity,Beijing100010,China)

Objective:To observe the efficacy of Xuebijing Injection on mice with severe pneumonia induced by influenza A virus and to explore the pathogenesis on mice with severe pneumonia. Methods: C57BL/6 mice were random grouped into three parts including normal group,model group and Xuebijing group. Mice in normal group were given 20 μL PBS by intranasal administration,while the model group 2×105TCID50/20 μL H1N1 virus in the same method. Mice in Xuebijing group were inoculated virus as volume as model group and then given injecta intraperitoneally daily for 5days.Survival rate, weight changes, viral load, acute pulmonary edema (lung wet-to-dry ratio) and lung histopathology at different time points were measured to evalue the efficacy of Xuebijing injuection on severe influenza and to study its pathogenesis. Results: The survival rate in model group was 30% with notable weight loss.The acute lung edema calculated by wet-to-dry ratio went up clearly compared with that in model group(P<0.05). Lung histopathology of model group indicated the success of severe pneumonia mice model showing that there were diffuse Inflammatory cell infiltration, sheding and necrosis of alveolar epithelial cells, degeneration of bronchial epithelial cells，pulmonary edema and hemorrhage. The survival rate in model group was 60% superior to model group with light weight lose. Wet-to-dry ratio was alleviated in Xuebijing group,but with no statistical differences(P>0.05).The manifestation of lung histopathology in Xuebijing group was as same as model group but the degree of lung injure in this group was eased dramaticlly. There was no difference in viral load between model group and Xuebijing group(P>0.05).It indicated that Xuebijing had no effect on inhibiting the replication of the influenza virus.It could reduce the level of TNF-αat one and 3 days post infection(P<0.05)and the level of IL-6 of 3days infection(P<0.05). Conclusion:Xuebijing could alleviate lung injury of severe pneumonia mice and have the tend of protecting those mice. But the protective effect was not prominent which may be related with its no effect on inhibiting virus but its regulation of some early cytokines,such as TNF-αand IL-6.

Influenza; Traditional Chinese Medicion; Xuebijing injection

北京市衛(wèi)生系統(tǒng)高層次衛(wèi)生人才培養(yǎng)計劃(編號：2011-3-081)

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.02.023