苦杏仁對照提取物替代苦杏仁對照藥材的可行性研究

袁少雄 李向日

(北京中醫藥大學中藥學院，北京，100102)

中藥研究

苦杏仁對照提取物替代苦杏仁對照藥材的可行性研究

袁少雄 李向日

(北京中醫藥大學中藥學院，北京，100102)

目的：以對照藥材技術要求為基礎，以等量同質為原則，利用現代的提取制備技術，制備成質量穩定、均勻性好的苦杏仁對照提取物。通過考察不同的薄層系統，建立薄層鑒別用對照提取物的質量標準，供中藥標準中薄層鑒別使用。并對其主要藥效成分進行方法學考察，確保今后制備的對照提取物的一致性。方法：采用不同薄層色譜系統對苦杏仁對照提取物可替代對照藥材進行定性研究；并用高效液相色譜法測定苦杏仁對照提取物中苦杏仁苷的含量。結果：在苦杏仁對照提取物薄層色譜中，展開劑：為甲苯-甲酸乙酯-甲醇-甲酸-水(6∶2∶0.4∶0.1∶0.1)，在與對照藥材色譜相應位置上，顯相同顏色的斑點。HPLC測定苦杏仁對照提取物中苦杏仁苷含量，苦杏仁苷線性范圍461.7～15.39 mg/L(r=0.999 5)，平均回收率為101.1%(RSD=2.15%)，該方法準確、可靠、專屬性強，重復性好。結論：苦杏仁對照提取可替代對照藥材進行定性鑒別。

對照提取物；等量同質；定性；定量

苦杏仁系杏或山杏等果實的種子，苦杏仁為多基源品種，本品為薔薇科植物山杏PrunusarmeniacaL.var.ansuMaxim.、西伯利亞杏PrunussibiricaL.、東北杏Prunusmandshurica(Maxim.) Koehne或杏PrunusarmeniacaL.的干燥成熟種子[1-3]。主要有效成分為苦杏仁苷和脂肪油，主產于我國遼寧、內蒙古、河北、山東、陜西、山西、甘肅、新疆等地[4]。苦杏仁不僅具有潤肺、止咳、平喘等功效，用于咳嗽氣喘，胸滿痰多，血虛津枯，干燥便秘[5]，而且具有防癌、抗癌的作用[6]。

2010年版《中華人民共和國藥典》收載了16種藥材、揮發油或組分對照提取物。根據它們的實際應用情況，分為3類:1)藥材或揮發油對照提取物；2)組分對照提取物；3)標示了多個待測成分含量的對照提取物[7]。苦杏仁為種子類藥材，含油脂類成分較多，其對照藥材易酸敗，不宜儲存。本實驗以等量同質為原則，研究制成苦杏仁對照提取物來代替苦杏仁對照藥材作為苦杏仁標準中薄層鑒別用對照物質發放。

1 儀器和試劑

Waters液相色譜儀(1525泵，2489檢測器，Waters公司)；PL2002電子天平(梅特勒-托科多儀器有限公司)；RE-52A旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；SB 25-12 DTDN型超聲清洗儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；SHB.95型循環水真空泵(鄭州杜甫儀器廠)；XMTD-6000電熱恒溫水浴鍋(長風)；DHG-9070A電熱鼓風干燥箱(常州諾基儀器有限公司)。苦杏仁苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110820-201305)。苦杏仁對照藥材(中國食品藥品檢定研究院，批號121554-201103)。所用藥材購自同仁堂等藥店，經北京中醫藥大學楊瑤珺教授鑒定為薔薇科植物東北杏(PrunusMandshurica(Maxim.) Koehne)的干燥成熟種子。甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 提取工藝的考察 不同的提取溶劑、料液比、提取時間對苦杏仁對照提取物薄層色譜有不同的影響[8]，本實驗在單因素實驗的基礎上，把薄層色譜直觀的清晰度和有效的信息量作為提取工藝的考察指標，同時，遵循對照提取物與對照藥材等量原則，盡可能地與對照藥材相應位置上斑點一致。通過對不同的因素比較，優選出苦杏仁對照提取物的最佳提取工藝。

2.1.1 提取溶劑的考察 因素水平：參考有關苦杏仁的提取工藝研究，選取60%乙醇、80%乙醇、95%乙醇為單因素考察水平，進行實驗，選擇的提取溶劑要盡量能充分提取該藥材的大部分化學成分。實驗方法：取生苦杏仁合格藥材，粉碎，稱取粗粉10 g。加入10倍量的溶劑加熱回流1 h，過濾，殘渣再用8倍量的溶劑加熱回流1 h，過濾，合并兩次濾液。

表1 提取工藝實驗設計表

結論：當乙醇濃度為95%時，苦杏仁對照提取物的薄層色譜分離度較好，斑點清晰可見，與對照藥材相應位置上，顯相同顏色的斑點，不同極性的成分大部分被提取出來。因此選擇95%乙醇為提取溶劑(圖1)。

圖1 不同濃度溶劑苦杏仁對照提取物色譜圖 1 苦杏仁苷對照品 2 95%乙醇對照提取物 3 80%乙醇 對照提取物 4 60%乙醇對照提取物 5 苦杏仁對照藥材表2 提取工藝實驗設計表

乙醇濃度(%)提取時間(h)提取次數溶媒倍數951210和8951210和695128和6

圖2 不同料液比苦杏仁對照提取物色譜圖 1 苦杏仁苷對照品 2 8:6對照提取物 3 10:8對照提取物 4 10:6對照提取物 5 苦杏仁對照藥材

2.1.2 料液比的考察 因素水平：選取95%乙醇為提取溶劑，料液比分別為：1∶10和1∶8、1∶10和1∶6、1∶8和1∶6。選擇的提取溶劑的比例要盡量能充分提取該藥材的大部分化學成分，且與對照藥材的相應位置上顯相同顏色的斑點。實驗方法：取生苦杏仁合格藥材，粉碎，稱取粗粉10 g。加入一定量的95%乙醇加熱回流1 h，過濾，殘渣再用一定量的95%乙醇加熱回流1 h，過濾，合并兩次濾液。

結論：當料液比為1∶10和1∶8時，苦杏仁對照提取的薄層色譜分離度較好，斑點清晰，苦杏仁對照提取物與其對照藥材相應位置上的斑點數目未改變。故選取料液比為1∶10和1∶8(圖2)。

2.1.3 提取時間的考察 選用95%的乙醇為提取溶劑，料液比為1∶10和1∶8，提取時間分別為0.5 h、1 h、1.5 h，其他操作同“2.1.1”和“2.1.2”項下提取法處理。在對照提取物與對照藥材斑點一致的情況下，節省提取時間，縮短工時，提高生產效率。

表3 提取工藝實驗設計表

結論：當提取時間為1 h時，苦杏仁對照提取的薄層色譜效果明顯，隨著時間增長，薄層效果沒有明顯變化，故最佳的提取是時間為1 h(圖3)。

圖3 不同提取時間苦杏仁對照提取物色譜圖 1 苦杏仁苷對照品 2 0.5 h對照提取物 3 1 h對照提取物 4 1.5 h對照提取物 5 苦杏仁對照藥材

綜上，考察結果表明最佳的提取工藝條件為：乙醇濃度為95%，提取時間為1 h，提取2次，料液比分別為1∶10和1∶8。通過此工藝條件提取出苦杏仁藥材的大部分化學成分，對照提取物得到的薄層色譜分離度較好、斑點容量大且清晰度好，與等量的苦杏仁對照藥材相應位置上，顯相同顏色斑點。因此采用以上方法提取苦杏仁對照提取物。

2.2 對照提取物的制備 取生苦杏仁合格藥材，粉碎，取粗粉100 g。10倍量的95%乙醇加熱回流1 h，過濾，殘渣再用8倍量95%乙醇加熱回流1 h，過濾，合并兩次濾液。濾液于50 ℃減壓回收乙醇至適度的濃縮液，冷卻至室溫，得到45.68 g浸膏，加入8倍量糊精，制成軟材，擠壓制粒，濕顆粒于60 ℃常壓干燥5 h。在干燥器中冷卻30 min整粒。制成苦杏仁對照提取物顆粒。

2.3 對照提取物與對照藥材薄層比較

2.3.1 對照提取物與對照藥材薄層比較方法一

2.3.1.1 供試溶液的制備 取本品粉末2 g，置索氏提取器中，加二氯甲烷適量，加熱回流2 h，棄去二氯甲烷液，藥渣揮干，加甲醇30 mL，加熱回流30 min，放冷，濾過，濾液作為供試品溶液。另取苦杏仁對照藥材0.1 g，同法制成苦杏仁對照藥材溶液。另取苦杏仁苷對照品，加甲醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.3.1.2 薄層色譜 取苦杏仁對照提取物、苦杏仁對照藥材、苦杏仁苷對照品溶液各7 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)5～10 ℃放置12 h的下層溶液為展開劑，展開，取出，立即用0.8%磷鉬酸的15%硫酸乙醇溶液浸板，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰(圖4)。

圖4 苦杏仁對照提取物的薄層色譜圖 1 苦杏仁對照提取物 2 苦杏仁對照提取物 3 苦杏仁對照提取物 4 苦杏仁對照提取物 5 苦杏仁對照藥材 6 苦杏仁苷對照品

圖5 苦杏仁對照提取物的薄層色譜圖 1 苦杏仁對照提取物 2 苦杏仁對照提取物 3 苦杏仁對照提取物 4 苦杏仁對照提取物 5 苦杏仁對照藥材 6 苦杏仁苷對照品

2.3.2 對照提取物與對照藥材薄層比較方法二

2.3.2.1 供試溶液的制備 取苦杏仁對照提取物0.3 g，加乙醇20 mL，加熱回流提取2 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取苦杏仁對照藥材0.1 g，同法制成苦杏仁對照藥材溶液。精密稱取苦杏仁苷對照品2 mg，加甲醇1 mL溶解，制成苦杏仁苷對照品溶液。

2.3.2.2 薄層色譜 取苦杏仁對照提取物、苦杏仁對照藥材藥材、苦杏仁苷對照品溶液各6 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-甲酸乙酯-甲醇-甲酸-水(6∶2∶0.4∶0.1∶0.1)為展開劑，展開，取出晾干，噴以1%香草醛乙醇溶液-3%高氯酸水溶液(1∶1)。在105 ℃下烘10 min。結果顯示：供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點(圖5)。

通過以上薄層圖顯示，方法二中對照提取物顯示的成分信息容量大，斑點清晰，分離度較好，與對照藥材相對應的位置上顯示相同顏色的斑點。因此采取薄層方二作為苦杏仁對照提取物替代苦杏仁對照藥材的薄層鑒別方法。

2.4 對照提取物中苦杏仁苷的含量測定 為了確保今后制備的對照提取物的一致性，應對對照提取物中的主要成分進行含量測定。按照含量測定的要求建立對照提取物含量測定方法，并進行相應的方法學考察。

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Waters C18色譜柱(Extend 4.6 mm×250 mm，4.5 μm)；流動相：乙腈-0.2%磷酸(1∶9)；流速：1 mL/min；波長207 nm；柱溫：40 ℃；進樣量：15 μL。

2.4.2 對照品溶液的制備 取苦杏仁苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含40 μg的溶液，即得。

圖6 苦杏仁對照提取物中苦杏仁苷的HPLC圖譜 A 苦杏仁苷色譜峰；B 苦杏仁對照提取物色譜峰

2.4.3 供試品溶液的制備 取苦杏仁對照提取物約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 KHz)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，精密量取續濾液5 mL，置10 mL容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，過0.45 μm微孔濾膜，取續濾液，既得供試品溶液。

2.4.4 線性關系考察 將上述苦杏仁苷對照品溶液稀釋成不同系列濃度的對照溶液，在上述色譜條件下分別進樣測定，以苦杏仁苷濃度(mg/L)為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)繪制標準曲線，回歸方程為:Y=0.000 2X+6.669 5，r=0.999 5(n=6)，表明苦杏仁苷461.7～15.39 mg/L范圍內線性關系良好。

2.4.5 精密度試驗 精密稱取苦杏仁苷對照品92.34 mg/L，連續進樣6次。保留時間t的RSD=1.02<2，峰面積S的RSD=1.73<2。

2.4.6 穩定性試驗 取同一供試品溶液，依次在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h進樣15 L，按上述色譜條件測定峰面積，得RSD為2.66%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.4.7 回收率試驗 精密稱取已知含量的苦杏仁對照提取物0.5 g 6份，精密加入苦杏仁苷對照液適量，按“2.4.3”項下制備供試液，依法測定，計算平均回收率為98.3%，RSD=3.2%。結果見表4。

表4 回收率的測定結果(n=6)

2.4.8 重復性 按照“2.4.3”項下供試品制備方法，用同1批次藥材制備6份供試品溶液，按照“2.4.1”項下色譜條件進行分析，計算苦杏仁苷的峰面積的RSD=4.42%。

2.5 對照提取物穩定性考察 采用提取物作為標準參考物質，要求其具有滿意的穩定性，能夠在較長的時間內使用[9]。采用薄層鑒定的方法考察其穩定性，每個月進行標定。

2.5.1 高溫、高濕考察實驗 將本實驗制取的苦杏仁對照提取物進行高溫、高濕實驗，按照“2.3.1”項下制備苦杏仁對照提取物供試品溶液，進行薄層鑒別實驗。結果苦杏仁對照提取物的薄層色譜斑點模糊，且分離度降低，故苦杏仁對照提取物適宜在低溫或者室溫下干燥密封保存。

2.5.2 加速穩定性實驗 將苦杏仁對照提取物進行長期實驗考察，長期實驗已完成6個月的實驗，將對照提取物按“2.3.1”項下制備苦杏仁對照提取物供試品溶液，進行薄層色譜實驗。結果苦杏仁對照提取物薄層色譜基本無明顯變化，斑點清晰可見，與對照藥材相應位置上，顯相同顏色斑點。

3 討論

中藥具有成分多樣性、復雜性等特點，所以需要建立多成分及多指標的質控評價標準。對于提高臨床療效近30年來隨著對照藥材品種不斷擴大及用量日益增多，目前對照藥材在研制和標準使用中存在以下問題如：1)中藥材所含的化學成分多樣，導致一些對照藥材制備困難，批次間一致性難以保證；2)部分藥材的穩定性差；3)一些含糖較多的果實類、根莖類藥材黏度大，難以粉碎；4)一些種子類藥材，含油脂類成分較多，易酸敗等問題。根據上述問題，有針對性地選擇代表性的品種，以對照藥材研制技術要求為基礎，以等量同質為原則，利用現代的提取制備技術，制備質量穩定性好、均勻性好，且易于生產、流通、貯存和使用的對照藥材提取物，作為中藥標準中薄層鑒別用對照物質發放，不僅有利于對照藥材的質量保證和提高，同時也必將大大方便其在標準中的使用，確保藥品標準的有效執行。同時，針對化學對照品制備、分離難度大，單體不穩定，隨之帶來生產成本、技術要求的提高等問題。對照提取物與對照品相比，對照提取物穩定性好，而且能保證良好的均勻度，同時制備分離簡單，節約了經濟成本，降低了生產難度[7]。因此，對照提取物在中藥產業市場中，有良好的發展前景，應大力推廣對照提取物的市場地位。本實驗以苦杏仁對照提取物為例，從提取工藝、制備工藝、薄層鑒定和含量分析等方面探討了苦杏仁對照提取物的研制。為苦杏仁藥材的質量控制提供了新形式的對照物質，充分彌補了苦杏仁對照藥材不易保存、穩定性和均勻性差的問題，同時，也為其他中藥材對照提取物替代對照藥材提供了可借鑒的思路和方法[9]。對藥品實施科學、合理、先進、實用的質量監控[10]，降低對照品制備成本和檢驗成本，又可以體現多指標質量控制的目的[11]。在以多成分質量控制為趨勢的大環境下，對照提取物測定法有更大的發展空間[12]然而，對照提取物也存在其自身的缺點與不足，希望在以后中醫藥事業發展的道路上，不斷完善對照提取物質量控制的標準[13-15]。

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(2014-05-25收稿 責任編輯：徐穎)

Feasibility Study on Replacement Drug of Semen Armeniacae Amarum Reference

Yuan Shaoxiong,Li Xiangri

(SchoolofChineseMateriaMedica,BeiingUniversityofChineseMedicine,Beijing100102,China)

Objective:On the basis of the control reference drug technical requirements and the principle of equivalent homogeneity,using modern extraction and preparation technology to prepare a stable quality and good uniformity of Semen Armeniacae Amarum

ubstance.By investigating the thin layer of different system,to establish the quality standards of thin layer identification with reference extract,for the use of thin layer identification in traditional Chinese medicine (TCM) standard.To investigate methodology and its main efficacy components to ensure the consistency.Methods:Different thin layer chromatographic system for Semen Armeniacae Amarum reference substance qualitative alternative was used to the reference drug research.An HPLC method for content determination of amygdalin in Semen Armeniacae Amarum reference substance was established.Results:In Semen Armeniacae Amarum reference substance in thin layer chromatography,the mobile phase was consisted of toluene- ethyl formate- methanol- formic acid and water (6∶2∶0.4∶0.1-0.1),and chromatographic corresponding to the position,the same color spots.To establish an HPLC method for content determination of amygdalin in Semen Armeniacae Amarum reference substance,the linear range of amygdalin was from 461.7 to 15.39 mg/L (r = 0.999 5),and the average recovery was 101.1% (RSD = 2.15%),The method was accurate,reliable,strong specialization and good repeatability．Conclusion:Semen Armeniacae Amarum reference substance can replace Semen Armeniacae Amarum reference drug for qualitative identification.

Reference substance; Equivalent homogenous; Qualitative; Quantitative

保健食品中違禁物質檢測技術研究(編號：2012BAK08B02)
作者介紹：袁少雄(1986.12—)，女，北京中醫藥大學在讀碩士研究生，研究方向：中藥質量控制及中藥炮制研究，E-mail：18010107996@163.com，地址：北京朝陽區望京中環南路6號北京中醫藥大學

R284.2

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.02.024