復(fù)方黃連素片中鹽酸小檗堿含量測(cè)定

席桂同 陳 述

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京海淀，100091)

復(fù)方黃連素片中鹽酸小檗堿含量測(cè)定

席桂同 陳 述

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京海淀，100091)

目的:建立測(cè)試黃連素片中鹽酸小檗堿含量的高效液相方法，并對(duì)此方法進(jìn)行系統(tǒng)的方法學(xué)驗(yàn)證，以確保應(yīng)用該方法測(cè)試的結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。方法:采用色譜柱:Agilent TC-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm，Agilent，美國(guó))，流動(dòng)相:乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(45∶55，含5%的0.05 mol/L庚烷磺酸鈉溶液)，檢測(cè)波長(zhǎng)為265 nm。結(jié)果:鹽酸小檗堿在2.5～80 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，得到線性回歸方程為Y=421.5X+17.32，相關(guān)系數(shù)為0.999 7(n=6);低、中、高濃度批內(nèi)精密度的RSD值分別為0.30%、0.58%、0.30%，批間精密度的RSD為0.80%;重復(fù)性RSD為0.27%;低、中、高濃度的加樣回收率分別為99.66%、99.88%、99.98%;供試品溶液室溫放置8h穩(wěn)定，RSD為0.41%。結(jié)論:本方法測(cè)定黃連素片中鹽酸小檗堿的含量準(zhǔn)確、可靠，操作簡(jiǎn)單、用時(shí)短，可用于黃連素片中鹽酸小檗堿的含量測(cè)定。

高效液相色譜法;鹽酸小檗堿;黃連素片;含量測(cè)定

復(fù)方黃連素片是由鹽酸小檗堿、木香、吳茱萸、白芍等幾味中藥組成的復(fù)方制劑，是一種臨床常用藥，用于治療濕熱痞滿，嘔吐瀉痢，高熱口渴，疔毒癰腫，目赤牙痛，心火力盛，心煩不寐，血熱吐衄等[1]。鹽酸小檗堿為毛茛科植物黃連根莖中所含的一種主要生物堿[2]，可由黃連、黃柏或三棵針中提取，也可人工合成。本品對(duì)細(xì)菌只有微弱的抑菌作用，但對(duì)痢疾桿菌、大腸桿菌引起的腸道感染有效[1]。筆者采用高效液相方法建立了實(shí)用、準(zhǔn)確、可靠的鹽酸小檗堿含量檢測(cè)方法，通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法回收率、準(zhǔn)確度及重現(xiàn)性均為良好，具體敘述如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器與設(shè)備 島津265型紫外分光光度計(jì);Agilent 1290型高效液相色譜儀(配有脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、恒溫箱、液相色譜泵、柱溫箱及熒光檢測(cè)器)，由Chemstation化學(xué)工作站系統(tǒng)控制(Agilent，德國(guó));METTLER TOLEDO AB135-S型十萬(wàn)分之一天平(METTLER，瑞士);XW-80A渦旋混合器(上海滬西分析儀器廠);TGL16M型冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司);AHL-2001-P痕量型分析型超純水機(jī)(艾科浦，重慶頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司)。

1.2 試藥與材料 鹽酸小檗堿對(duì)照品:由中國(guó)藥品生物制品檢定研究院提供，批號(hào):0731-200507;黃連素片:由四川某股份有限公司提供，批號(hào):140210、140212、140214、140217、140219;磷酸二氫鉀:天津科密歐化學(xué)試劑有限公司，分析純，批號(hào):131126;乙腈:美國(guó)Tedia公司，色譜純，批號(hào):1210574;純水:自制去離子超純水。

2 方法

2.1 色譜條件 色譜柱:Agilent TC-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm，Agilent，美國(guó));保護(hù)柱:Gemini C18(4 mm×3.0 mm，10 μm，Phenomenex，美國(guó));流動(dòng)相:乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(45∶55，含5%的0.05 mol/L庚烷磺酸鈉溶液);流速:1.2 mL/min;柱溫:35 ℃;進(jìn)樣量:5 μL。檢測(cè)波長(zhǎng)265 nm。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品50 mg(稱量前需將鹽酸小檗堿對(duì)照品于100 ℃干燥至恒重)，置于50 mL容量瓶中，加適量50%乙腈水溶液溶解后，再用流動(dòng)相50%乙腈水溶液稀釋至刻度線，搖勻，即得濃度為1 mg/mL的鹽酸小檗堿對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，置于4 ℃冰箱保存。

2.2.2 供試品溶液的配制 取黃連素片10片，精密稱定，研碎，精密稱取適量(約含鹽酸小檗堿5 mg)，置于帶塞錐形瓶中，加入約20 mL 50%乙腈水溶液，超聲處理0.5 h，充分搖勻，冷卻至室溫，完全轉(zhuǎn)移至50 mL的容量瓶中，再用50%乙腈水溶液定容至刻度線，搖勻。精密移取進(jìn)樣前5 mL上述溶液至50 mL的容量瓶中，用流動(dòng)性定容至刻度線，充分搖勻，再用0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾后，取續(xù)濾液進(jìn)樣5 μL。

2.2.3 陰性對(duì)照液 制備缺少黃連的空白黃連素片(鹽酸小檗堿成分以基質(zhì)代替，其余處方同復(fù)方黃連素片)，再按“2.2.2供試品溶液的配制”項(xiàng)下方法，配制成陰性樣品溶液。

3 結(jié)果

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 以流動(dòng)相作為空白對(duì)照，將鹽酸小檗堿對(duì)照液和供試品溶液在紫外分光光度計(jì)上掃描，掃描區(qū)間為200～300 nm，結(jié)果得出，鹽酸小檗堿在265 nm處顯示有最大吸收。因此，選擇265 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 系統(tǒng)適用性與專屬性考察 分別取鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照液、供試品溶液適量，在上述色譜條件下進(jìn)樣20 μL。記錄并觀察3份溶液的色譜圖。結(jié)果得出，鹽酸小檗堿峰的理論塔板數(shù)不低于3 000，陰性對(duì)照液中無(wú)干擾峰干擾測(cè)定，對(duì)照液與供試液中鹽酸小檗堿峰的保留時(shí)間一致，鹽酸小檗堿峰周圍無(wú)干擾峰，基質(zhì)不干擾測(cè)定，本方法專屬性好。典型色譜圖如下圖1所示。

3.3 線性關(guān)系考察 精密移取濃度為1 mg/mL的鹽酸小檗堿對(duì)照品儲(chǔ)備溶液適量，用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋成含鹽酸小檗堿濃度為80、40、20、10、5、2.5 μg/mL等6個(gè)濃度級(jí)別的系列對(duì)照品工作溶液，進(jìn)樣5 μL。記錄各濃度鹽酸小檗堿對(duì)照液的峰面積。結(jié)果得出，鹽酸小檗堿在2.5～80 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，以鹽酸小檗堿濃度為橫坐標(biāo)，所得峰面積為縱坐標(biāo)，得線性回歸方程為Y=421.5X+17.32，相關(guān)系數(shù)為0.999 7(n=6)。

圖1 專屬性考察圖譜

3.4 精密度考察 配制低、中、高濃度(鹽酸小檗堿濃度為5、20、64 μg/mL)的對(duì)照品工作溶液，每個(gè)濃度平行配制5份，分別進(jìn)樣5 μL，記錄峰面積，見(jiàn)表1。結(jié)果得出，低、中、高濃度鹽酸小檗堿的RSD值分別為0.30%、0.58%、0.30%，表明鹽酸小檗堿批內(nèi)精密度良好。

另取鹽酸小檗堿濃度為20 μg/mL的對(duì)照品工作溶液，連續(xù)3 d，每天平行5份測(cè)定，記錄峰面積，見(jiàn)表2。結(jié)果得出，鹽酸小檗堿的RSD值為0.80%，表明鹽酸小檗堿批間精密度良好。

表1 批內(nèi)精密度考察結(jié)果

表2 批間精密度考察結(jié)果

3.5 重復(fù)性考察 取同一批次的供試品6份，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法配制成6份供試品溶液，進(jìn)樣5 μL，記錄峰面積，見(jiàn)表3。結(jié)果得出鹽酸小檗堿峰面積的RSD值為0.27%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

表3 重復(fù)性考察結(jié)果

3.6 加樣回收率考察 精密移取同一已知(10.01 μg/mL)的供試品溶液1 mL，平行5份，分別加入低、中、高濃度(鹽酸小檗堿濃度為5、20、64 μg/mL)的對(duì)照品工作溶液1 mL，混勻，進(jìn)樣，記錄峰面積，見(jiàn)表4。本實(shí)驗(yàn)所得鹽酸小檗堿低、中、高濃度的加樣回收率分別為99.66%、99.88%、99.98%，RSD分別為0.37%、0.32%、0.58%。

表4 加樣回收率考察結(jié)果

3.7 穩(wěn)定性考察 取同一份供試品溶液(10.01 μg/mL)，分別在室溫下放置0、4、6、8 h后測(cè)定，記錄色譜峰，見(jiàn)表5。結(jié)果得出，在室溫下放置8 h后測(cè)定的RSD值為0.41%，可說(shuō)明鹽酸小檗堿供試品溶液室溫放置8 h穩(wěn)定。

表5 室溫放置穩(wěn)定性考察結(jié)果

3.8 樣品含量測(cè)定 取5個(gè)批次(批號(hào)分別為140210、140212、140214、140217、140219)的黃連素片，按上述“2.2.2”項(xiàng)下方法配制成供試品溶液，取配制好的供試品溶液，進(jìn)樣5 μL，每個(gè)批次平行測(cè)定3次，記錄峰面積，采用外標(biāo)法計(jì)算復(fù)方黃連素片中鹽酸小檗堿的含量，含量計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表6。5個(gè)批次供試品溶液中的鹽酸小檗堿的含量分別為10.068、9.987、10.028、10.021、9.985 μg/mL。

表6 含量測(cè)定結(jié)果

4 小結(jié)

復(fù)方黃連素片是由鹽酸小檗堿、木香、吳茱萸、白芍等幾味中藥組成的復(fù)方制劑，具有清熱燥濕，行氣止痛、止痢止瀉的作用。復(fù)方黃連素片是一種臨床常用藥，用于治療濕熱痞滿，嘔吐瀉痢，高熱口渴，疔毒癰腫，目赤牙痛，心火力盛，心煩不寐，血熱吐衄等[1]。復(fù)方黃連素片中鹽酸小檗堿為君藥，鹽酸小檗堿的含量對(duì)復(fù)方黃連素片制劑的質(zhì)量控制具有重要的作用。《中華人民共和國(guó)藥典》和藥品標(biāo)準(zhǔn)中均有鹽酸小檗堿的HPLC含量測(cè)定方法，但是標(biāo)準(zhǔn)方法的色譜條件下，鹽酸小檗堿的峰型存在拖尾現(xiàn)象[3-10]。很多學(xué)者對(duì)鹽酸小檗堿含量測(cè)定方法進(jìn)行了深入的研究，取得了很好的效果[11-15]。本文對(duì)鹽酸小檗堿的HPLC測(cè)定方法進(jìn)行了研究，以更好的用于復(fù)方黃連素片的質(zhì)量控制。

為解決拖尾現(xiàn)象，本實(shí)驗(yàn)研究方法所用的流動(dòng)相為乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(45∶55，含5%的0.05 mol/L庚烷磺酸鈉溶液)，因?yàn)辂}酸小檗堿屬堿性較強(qiáng)的季銨型類生物堿，調(diào)節(jié)流動(dòng)相水相和有機(jī)相的比例，并在流動(dòng)相中加入緩沖溶液，加入離子對(duì)試劑增大離子強(qiáng)度有利于解決峰型拖尾問(wèn)題。經(jīng)過(guò)反復(fù)的試驗(yàn)，最終得出本研究中的流動(dòng)相組成，配合色譜柱、流速、柱溫等條件下，鹽酸小檗堿峰有較好的峰型，理論塔板數(shù)及分離度均為滿意。本研究所采用的樣品前處理方法為超聲提取法，該方法操作簡(jiǎn)便，研究發(fā)現(xiàn)超聲時(shí)間為30 min即能基本提取完全。總之，本實(shí)驗(yàn)所得方法操作簡(jiǎn)便，并經(jīng)過(guò)了方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果表明，本方法有較好的專屬性，精密度好，準(zhǔn)確度高，并有良好的重現(xiàn)性，提取回收率接近100%，可以作為復(fù)方黃連素片中鹽酸小檗堿的含量測(cè)定，用于該制劑的質(zhì)量控制，以確保其臨床用藥效果。

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(2014-04-26收稿 責(zé)任編輯：王明)

Content Determination of Berberine Hydrochloride in Compound Berberine Tablets

Xi Guitong,Chen Shu

(XiyuanHospital,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100091,China)

Objective:To establish the HPLC method to determine content of berberine hydrochloride in Berberine Tablets,and to ensure the results are accurate and reliable by systematical testing methodology.Methods:The chromatographic column:Agilent TC-C18column (4.6×150 mm,5 μ m,Agilent,America),mobile phase:acetonitrile-0.05 mol/L potassium dihydrogen phosphate (0.05 mol/L sodium heptanesulfonate solution 45∶55,5%),the detection wavelength was 265nm.Results:The berberine hydrochloride in 2.5ug·mL-1-80ug·mL-1linear relationship was good,and the linear regression equation was Y = 421.5X+17.32,and correlation coefficient was 0.9997 (n = 6); low,high concentration within batch precision values of RSD were 0.30%,0.58%,0.30%,inter batch precision RSD was 0.80%; repeatability RSD was 0.27%; the low,recoveries,in high concentrations were 99.66%,99.88%,99.98%; the test solution was placed at room temperature for 8h,and RSD was 0.41%.Conclusion:This method for determination of berberine hydrochloride in tablet of berberine is accurate and reliable with simple operation and short time.It can be used for content determination of berberine hydrochloride in tablets of berberine.

HPLC; Berberine hydrochloride; Berberine Tablets; Content determination

陳述，主管藥師，地址:北京市海淀區(qū)西苑醫(yī)院藥劑科，郵編:100091

R284.2

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.02.025