高山大黃的顯微及分子鑒定研究

費 燁 付深振 吳浩忠 李啟恩 多吉任青 陳 靜 閆興麗 魏勝利 高增平

(1 北京中醫藥大學中藥學院，北京，100102; 2 蘭州大學生命科學學院，蘭州，730000; 3 西藏藏醫學院，拉薩，850000)

高山大黃的顯微及分子鑒定研究

費 燁1付深振1吳浩忠1李啟恩2多吉任青3陳 靜3閆興麗1魏勝利1高增平1

(1 北京中醫藥大學中藥學院，北京，100102; 2 蘭州大學生命科學學院，蘭州，730000; 3 西藏藏醫學院，拉薩，850000)

目的:對蓼科藥用植物高山大黃進行顯微及分子鑒定研究。方法:采用石蠟切片、粉末制片對高山大黃根及根莖的橫切面組織結構和粉末特征進行顯微研究，并采用matK基因序列分析技術對高山大黃進行了分子鑒定研究。結果:高山大黃根橫切面中皮層寬，薄壁細胞中可見草酸鈣簇晶，木質部寬廣，導管徑向排列;根莖髓部寬廣，無異形維管束存在;粉末中草酸鈣簇晶多，棱角大多短鈍，導管木質化，多網紋導管，淀粉粒小而多。高山大黃matK序列全長1 524 bp，在基因上游106、218、222、365、522、615、711、759、801、852處存在十處堿基替換，且在950-955處存在CAAGAA6個堿基插入。結論:本研究獲得了高山大黃比較全面的鑒定信息，上述顯微特征可作為高山大黃顯微鑒定依據，其matK基因序列分析為高山大黃DNA條形碼研究奠定基礎。

高山大黃;顯微鑒定;分子鑒定

高山大黃是蓼科植物高山大黃RheumnobileHook.f.et Thoms或西伯利亞蓼PolygonumsibiricumLaxm的根莖[1]，為常用藏藥。高山大黃別名塔黃[2]，據《新華本草綱要》記載，其根亦可入藥[3]。高山大黃主產于西藏喜馬拉雅山麓及云南西北部[4]，形似寶塔[5]，因其淡黃色半透明苞葉對于包裹其中的總狀花序有類似溫室的保溫作用[6]而有“溫室植物”之稱。該藥性溫，味酸、苦，消腎性水腫，主治黃水病[2]。藏醫認為黃水是機體的組成物質之一，受“龍”“赤巴”“培根”支配，生理異變時形成黃水病。黃水病可擴散至肌肉，游竄到脈道，或著于骨，或降于臟器，范圍非常廣泛[7]。因其治療黃水病的療效顯著可靠，高山大黃在當地深受百姓青睞。到目前為止，僅有關于其苞葉的化學成分[6]和生態功能[8]等研究，未見有關高山大黃的鑒定研究報道，為了全面了解這一神秘的高山植物，本研究揭示了高山大黃的橫切面及粉末的顯微特征和matK基因序列的特異性位點，為該藥用植物的鑒定提供了科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗材料采集自西藏，經西藏藏醫學院嘎烏教授鑒定為蓼科(Polygonaceae)大黃屬(Rheum)高山大黃RheumnobileHook.f.et Thoms。實驗材料來源信息見表1。

表1 實驗材料來源信息

1.2 儀器 八兩高速中藥粉碎機LG-08A(浙江瑞安市百信藥機器械廠);切片機SHANDON FINESSE325(北京鴻泰嘉業科技發展有限公司);TK-218型恒溫攤片拷片機(湖北泰維醫療科技有限公司);富士X10數碼相機;OLYMPUS BX 51顯微系統及DP71圖像采集系統。

1.3 方法

1.3.1 組織橫切制片 新鮮植物組織經FAA液(福爾馬林-冰醋酸-80%乙醇=5∶5∶90)固定，按常規石蠟切片法[9]，經過脫水、透明、浸蠟、包埋、修塊、切片、展片烘干、脫蠟步驟后，以番紅和固綠染色，制成永久石蠟切片，在顯微鏡下觀察成像。

1.3.2 粉末制片 將高山大黃的根及根莖粉碎，過60目篩，取適量粉末水合氯醛透化，并滴加間苯三酚-鹽酸制片，進行顯微觀察。

1.3.3 DNA分子鑒定 1)DNA提取：取藥材約100 mg，在預先冷凍的研缽中加液氮研磨成細粉。其余按照博邁德公司廣譜植物基因組DNA提取試劑盒說明操作。1%瓊脂糖凝膠電泳驗證DNA質量。所得DNA-200 ℃保存。2)擴增引物:大黃matK序列PCR擴增的引物采用日本Rersearch Center for Ethnomedicines，Institute of Natural Medicine，Toyama Medical and Pharmaceutial University設計的三對引物，由上海生工生物工程技術有限公司合成，引物信息及退火溫度見表2。3)擴增PCR體系:PCR擴增反應在50 μL的體系中完成。反應體系:滅菌ddH2O 30 μL，10×Buffer5 μL，1.5 mmol/LMgCl2/NTP4 μL，引物2 μL，模板1 μL，TaqDNA聚合酶l μL。DNA模板約50 ng。4)PCR擴增程序:95 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，50 ℃退50 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環后，72 ℃延伸10 min。5)測序:PCR擴增結果經瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后送上海生工生物工程有限公司北京測序部進行雙向測序。6)序列分析:測序結果用CondonCode軟件進行峰圖分析，去除低質量序列及引物端。用ContingExpress軟件對序列進行拼接，對拼接后的序列進行手工校正，根據大黃屬matK界限截取高山大黃的matK序列。

表2 matK擴增引物片段及退火溫度

2 結果

2.1 根橫切面 類圓形。木栓層2-4列細胞，排列緊密。皮層較寬，其間可見草酸鈣簇晶散在。韌皮部較窄，韌皮射線明顯，形成層整體成環，波狀彎曲。木質部寬廣，占橫切面1/2以上，木質部射線明顯，導管木質化成束徑向排列，近中心處單個散在。薄壁細胞含草酸鈣簇晶。見圖1。

圖1 高山大黃根的顯微結構

2.2 根莖橫切面 類圓形。木栓層數列細胞，栓內層排列緊密，充滿紅棕色物質。皮層較窄，韌皮部細胞小，排列緊密，射線明顯1-4列細胞，形成層整體成環狀。木質部較寬，木質部導管徑向排列。髓部寬廣，薄壁細胞排列疏松，無異形維管束存在。薄壁細胞含草酸鈣簇晶。見圖2。

圖2 高山大黃根莖的顯微結構表3 高山大黃matK序列對比(以掌葉大黃Pq1 matK序列為參比，*表示與之相同基因，-表示序列空缺位點)

SpeciesSamplesNucleotideposition1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 6 7 7 7 7 7 7 7 8 8 8 8 9 9 9 9 9 9 1 1 10 1 2 6 7 4 5 2 8 1 1 1 0 1 5 4 6 8 9 0 3 5 5 5 5 5 5 5 5 0 2 46 8 2 5 9 3 1 2 7 2 5 9 7 1 9 3 4 7 1 1 8 2 9 0 1 2 3 3 5 4 9 89 4 5RheumpalmatumPq1GTTGCTGCAAAACAGCACCCCAA------CTGRheumnobile1TAGAAAGTGTGCGGAACATAAGCCAAGAA*C*2TAGAAAGTG*GCGGAAT*TAAGCCAAGAAT*T3TAGAAAGTG*GCGGAAT*TAAGCCAAGAAT*T

2.3 粉末 淡黃棕色。草酸鈣簇晶多，直徑20～35 μm，棱角大多短鈍。導管木質化，多網紋，還有具緣紋孔及螺紋導管，直徑20～123 μm。木薄壁細胞排列整齊。淀粉粒小而多，單粒呈球形，直徑3～10 μm;復粒由2～5分粒組成，3復粒最為常見。見圖3。

圖3 高山大黃粉末特征圖

2.4matK序列特征分析 高山大黃matK序列經排序后長度為1 524 bp，通過將高山大黃與掌葉組和波葉組大黃的綜合比對[10]，結果發現高山大黃與其他組大黃存在統計學意義，具體表現為:在基因上游106、218、222、365、522、615、711、759、801、852處存在十處堿基替換，依次為T、A、G、A、T、G、G、A、A、G，而在950-955處存在CAAGAA 6個堿基插入。以上結果說明，高山大黃和其他組大黃在matK基因序列上存在顯著的差異，這些差異為進一步研究高山大黃DNA條形碼奠定了基礎。

3 討論

高山大黃根橫切面中皮層較寬，其間可見草酸鈣簇晶散在，木質部寬廣，占橫切面1/2以上，木質部射線明顯，導管木質化成束徑向排列，近中心處單個散在;根莖橫切面皮層較窄，韌皮部細胞小，排列緊密，射線明顯，形成層整體成環狀，髓部寬，無異形維管束存在;根及根莖粉末中草酸鈣簇晶多，棱角大多短鈍，導管木質化，多網紋，尚可見具緣紋孔及螺紋導管，木薄壁細胞排列整齊，淀粉粒小而多，單粒、復粒均有。以上特征可作為藏藥高山大黃的鑒別特征。

對比同屬藥用植物大黃，主要可以通過觀察根莖髓部是否有異型維管束，以及導管是否木質化來區分:大黃根莖髓部常有異型維管束散在，而高山大黃根莖髓部無異型維管束;大黃的導管非木質化，而高山大黃的導管木質化，間苯三酚-鹽酸染色后呈粉紅色。此外草酸鈣簇晶大小亦可作為參考依據，大黃的草酸鈣簇晶直徑20～160 μm，有的至190 μm[11]，而高山大黃的草酸鈣簇晶棱角大多短鈍，直徑20～35 μm。

matK基因序列分析技術客觀準確，通用性強，在序列校對完成后，對變異位點進行查找，以950-955處CAAGAA6個堿基插入作為高山大黃的主要特征，輔以基因上游106、218、222、365、522、615、711、759、801、852處存在的特異堿基T、A、G、A、T、G、G、A、A、G，為高山大黃的分子鑒定研究提供了科學依據。

在本研究中，筆者發現高山大黃無論在顯微鑒定還是分子鑒定層面都與同屬藥用植物表現出明顯的差異。高山大黃類“錦毛植物”，根系粗壯，花序由苞片包裹[12]，有學者對其苞葉進行了研究，發現CHS重復基因在苞葉和基葉中表達分化，降低紫外線透射率[13]，光合作用相關的基因在苞葉中表達量顯著下降，而另一些與植物脅迫響應相關的基因的表達量卻顯著升高，這些差異表達基因與其解剖特征和適應性功能密切相關[14]。研究還表明，高山大黃具有較高的羥基自由基、DPPH·清除率和良好的抗脂質過氧化能力，綜合抗氧化能力接近Vc[15]。筆者認為高山大黃導管的木質化，matK基因序列中950-955處6個堿基的插入，以及顯著的抗氧化活性，亦與其長期生活在高原環境密不可分，其相關性還有待進一步研究。

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(2014-05-12收稿 責任編輯：王明)

Microscopic and Molecular Identification of Rheum Nobile

Fei Ye1,Fu Shenzhen1,Wu Haozhong1,Duoji Renqing3,Chen Jing3Yan Xingli1,Wei Shengli1,Gao Zengping1

(1SchoolofChineseMateriaMedica,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100102,China； 2SchoolofLifeSciences,LanzhouUniversity,Lanzhou730000,China； 3TibetanTraditionalMedicalCollege,Lhasa850000,China)

Objective:To perform a study of the medicinal herbal microscopic and molecular identification of Rheum nobile radix and rhizome.Methods:The cross sections of Rheum nobile radix and rhizome were obtained by using paraffin sectioning,and temporary glycerol tablets with chloral hydrate were used to identify the microscopic structure of powder.The matK gene sequence analysis technique was used for molecular identification of Rheum nobile.Results:In the cross-section of radix,both the cortex and xylem were wide with vessels arranging radially and massive calcium oxalate crystal visible in parenchyma cells.Pith part was broad without any abnormal vascular bundle.Powder contained a mass of calcium oxalate crystals whose edges were mostly short blunt.There were lignified vessels and small starch grain as well.The length of matK gene sequence of Rheum nobile was 1 524 bp.Upstream of matK sequence,there were ten base-pair substitutions in 106,218,222,365,522,615,711,759,801,852,and 6 bases CAAGAA inserted in 950-955.Conclusion:The research tends to contain relatively comprehensive identification information of Rheum nobile.These microscopic features can be used as evidence for identification of Rheum nobile radix and rhizome,and the matK gene sequence analysis helps lay a foundation for Rheum nobile DNA barcoding research.

Rheum nobile; Microscopic identification; Molecular identification

北京中醫藥大學自主選題(藏醫藥類)課題資助項目(編號:2013-zyy-02)

R284.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.02.028