猴頭菇多糖對呼腸孤病毒感染番鴨腸道黏膜免疫及抗氧化能力的影響

黃麗娜，姜慧慧，王 潔，高 婷，張葉飛，吳寶成，吳異健*，黃一帆*

(1.福建農林大學動物科學學院，福州 350002；2.中西獸醫結合與動物保健福建省高校重點實驗室，福州 350002)

猴頭菇多糖對呼腸孤病毒感染番鴨腸道黏膜免疫及抗氧化能力的影響

黃麗娜1，2，姜慧慧1，2，王 潔1，高 婷1，張葉飛1，吳寶成1，2，吳異健1，2*，黃一帆1，2*

(1.福建農林大學動物科學學院，福州 350002；2.中西獸醫結合與動物保健福建省高校重點實驗室，福州 350002)

旨在研究猴頭菇多糖對感染番鴨呼腸孤病毒(MDRV)雛鴨腸道黏膜免疫和抗氧化能力的影響。通過建立模擬MDRV自然感染發病模型，將200只1日齡健康雛番鴨隨機分為空白對照組、猴頭菇多糖對照組、同居感染對照組和猴頭菇多糖預防組。各試驗組番鴨在同居感染后第1、3、6、10、15、21天，采集樣品測定各指標。結果顯示，猴頭菇多糖能夠不同程度促進感染呼腸孤病毒雛番鴨腸道SIgA、IFN-γ、IL-4的分泌，具有維持腸道黏膜免疫平衡的作用；且顯著(P<0.05)提高SOD活性和GSH含量，降低了MDA含量，具有提高機體抗氧化酶活性、清除體內自由基、抑制脂質過氧化的作用。結果表明，猴頭菇多糖對雛番鴨腸道黏膜免疫具有較顯著的調節作用，且能提高機體抗氧化能力，有效減輕呼腸孤病毒對其腸道屏障功能的損傷。

番鴨呼腸孤病毒；猴頭菇多糖；黏膜免疫；抗氧化能力

自1997年以來，呼腸孤病毒(muscovy duck reovirus，MDRV)在廣東、福建、浙江、廣西等地的番鴨飼養區流行?；疾‰r鴨表現為精神委頓，食欲減少以至廢絕，羽毛蓬松，無光澤，縮頸，擠堆，軟腳，多蹲伏，常出現腹瀉，排白色或綠色帶有黏液的稀糞，耐過鴨生長發育受阻。本課題組研究發現[1]，MDRV可導致雛番鴨的腸道出現不同程度的炎癥和損傷，腸黏膜充血、出血或有大小不等的壞死小點，部分病鴨小腸淋巴環帶明顯腫脹等。猴頭菇多糖(Hericiumerinaceuspolysaccharide，HEP)是從猴頭菇子實體、菌絲體及菌絲發酵液中分離得到的真菌多糖，是猴頭菇中最主要活性物質之一。有研究發現[2]，HEP是一個良好的免疫功能增強劑和一種良好的抗氧化物質。本課題組的預試驗及前期研究[3-4]顯示，人工攻毒感染MDRV的番鴨死亡率為90%，在HEP的干預下，其死亡率降為50%；同居感染MDRV的番鴨死亡率為53.3%，而HEP預防組的死亡率為12%，且HEP預防組出現相應臨床癥狀的時間比病毒對照組遲，說明HEP對MDRV具有較好的防治作用。因此本試驗擬通過比較分析HEP對MDRV感染雛番鴨腸道SIgA、IFN-γ、IL-4、MDA、SOD、GSH等指標的影響，進一步探討MDRV對雛番鴨腸道黏膜免疫及自由基的產生和清除的影響，及添加猴頭菇多糖對其免疫功能和抗氧化功能的改善作用。

1 材料與方法

1.1 病毒株及實驗動物

番鴨呼腸孤病毒為福建農林大學動物科學院預防獸醫學實驗室保存的YB分離株。試驗用1日齡健康雛番鴨來源于福建莆田無呼腸孤病毒感染某番鴨場。

1.2 試驗中藥

猴頭菇多糖(含量40%)購自于上海康舟真菌多糖有限公司。

1.3 試驗分組

將200只1日齡健康雛番鴨隨機分為空白對照組(BCG)、猴頭菇多糖對照組(HCG)、同居感染對照組(CICG)、猴頭菇多糖預防組(HPG)，每組50只。BCG、HCG與CICG、HPG獨立分開飼養管理。另取40只2日齡健康雛番鴨每只腿部肌肉注射10倍稀釋的YB株病毒液0.4 mL，并剪尾羽做好標記，獨立分開飼養管理。攻毒3 d后，分別取20只加入到CICG和HPG進行同居感染，此時記為同居感染第0天。HCG和HPG從1日齡起通過飲水口服猴頭菇多糖，添加量為0.2 g·L-1(此添加量為本課題組前面研究獲得[3])，直至整個試驗期結束。所有試驗番鴨飼喂雛鴨全價飼料，自由飲水采食。

1.4 試驗番鴨的樣本采集及處理

同居感染后第1天，隨機從BCG、HCG、CICG及HPG中分別取6只番鴨心臟采血處死，取兩段適量十二指腸于預冷的滅菌PBS緩沖液洗凈，用濾紙吸干。取其中一段稱重，置于2 mL樣品管中，加預冷生理鹽水1 mL，然后在100 ℃水浴中煮沸10 min，勻漿；4 ℃ 3 000 r·min-1離心15 min，取上清，-20 ℃保存，用于測定IL-4、IFN-γ的含量。另一段縱向剖開，用載玻片輕刮小腸黏膜，置于1.5 mL 滅菌Eppdeffer管中，稱重，加預冷生理鹽水1 mL，同上操作，用于測定SIgA、GSH、MDA的含量及SOD活性。此后，各試驗組番鴨在同居感染后第3、6、10、15、21天分別隨機取6只番鴨同上處理取樣。

1.5 免疫指標和抗氧化指標的檢測

分泌型免疫球蛋白A(SIgA)、IL-4、IFN-γ含量的測定，利用放射性免疫(RIA)的方法；超氧化物歧化酶(SOD)活性、還原型谷胱甘肽(GSH)含量和丙二醛(MDA)含量的檢測，利用比色法；以上操作均按照北京華英生物技術研究所試劑盒說明書的操作要求進行。

1.6 數據處理

不同同居感染時間各試驗組番鴨腸道組織及黏膜各指標數據均用“平均數±標準差”表示，試驗數據用SPSS 17.0進行單因素方差分析，用LSD多重比較法對數據進行顯著性檢驗，顯著性水平設為P<0.05。

2 結 果

2.1 猴頭菇多糖對MDRV感染雛番鴨腸道免疫指標的影響

由表1可知，雛番鴨感染呼腸孤病毒后，與BCG(空白對照組)相比較，其腸道分泌SIgA的水平分別降低了33.73%、43.56%、48.78%、58.12%、52.78%、48.79%，差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)。HCG(猴頭菇多糖對照組)、HPG(猴頭菇多糖預防組)與BCG相比，其腸道分泌SIgA的水平差異均不顯著(P>0.05)。HPG與HCG相比較，同居感染后第10天時，其腸道分泌SIgA的水平差異顯著(P<0.05)外，其余各時間點均差異不顯著(P>0.05)。HPG與CICG(同居感染對照組)相比，其腸道分泌SIgA的水平分別提高了59.73%、101.39%、112.09%、126.71%、96.89%、87.94%，差異均顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)。 HCG與CICG相比，其腸道分泌SIgA的水平差異均極顯著(P<0.01)。

由表2可知， CICG番鴨腸道IFN-γ分泌量，在同居感染后第3、6、15天時，顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)低于BCG。BCG、HPG與HCG相比，整個試驗期內其腸道IFN-γ分泌量均差異不顯著(P>0.05)。HPG與BCG相比，僅在同居感染后第3天時， IFN-γ分泌量顯著(P<0.05)較其低。HCG與CICG相比，在同居感染后第3、6、15天時，IFN-γ分泌量顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)較其高。HPG與CICG相比較，在同居感染后第3、6、21天時，IFN-γ分泌量差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)。

表1 試驗番鴨腸黏膜SIgA含量的變化

Table 1 Changes of the intestinal mucosal SIgA content in experimental ducklings ng·mg-1

同行數據肩標不同小寫字母者表示差異顯著(0.010.05)，下表同

The data in the same column，different superscript lowercase letters show significant difference(0.010.05)，the same as below

表2 試驗番鴨腸道組織IFN-γ含量的變化

Table 2 Changes of the intestinal tissue IFN-γ content in experimental ducklings pg·mg-1

由表3可知，在試驗期內，同居感染后第1、3、6天時，CICG番鴨腸道IL-4分泌水平均比其余3組低，但均差異不顯著(P>0.05)。同居感染后第10天時，CICG番鴨腸道IL-4分泌水平顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)低于其余3組。同居感染后第15天時，CICG腸道IL-4分泌水平極顯著(P<0.01)低于HCG，且HCG均高于BCG和HPG ，差異顯著(P<0.05)。同居感染后第21天時，除HPG顯著(P<0.05)高于CICG外，其余各組均差異不顯著(P>0.05)。

表3 試驗番鴨腸黏膜IL-4含量的變

Table 3 Changes of the intestinal tissue IL-4 content in experimental ducklings pg·mg-1

2.2 猴頭菇多糖對MDRV感染雛番鴨腸黏膜抗氧化指標的影響

由表4可知，整個試驗期內，CICG番鴨腸黏膜MDA含量均較其他3組高，與BCG相比，在同居感染后第3、10、21天時，出現顯著(P<0.05)差異；與HCG相比，在同居感染后第1、10天時，差異不顯著(P>0.05)外，其余各時間點均差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)；與HPG相比，在同居感染后第10天時，開始出現顯著性(P<0.05)差異。BCG與HCG相比，僅在同居感染后第15天時，出現顯著(P<0.05)變化。HPG與BCG、HCG相比，在同居感染后各個時間點差異均不顯著(P>0.05)。

表4 試驗番鴨腸黏膜MDA含量的變化

Table 4 Changes of the intestinal mucosal MDA content in experimental ducklings nmol·mg-1

由表5可知，雛番鴨在同居感染MDRV后，其腸黏膜SOD活性呈現波動式變化，但均比對照組低，僅在同居感染后第10天時，出現顯著(P<0.05)低于BCG。與HCG相比，CICG腸黏膜SOD活性，除同居感染后1、6天時，與其差異不顯著(P>0.05)外，其余各時間點均顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)較其低。與HPG相比，CICG組腸黏膜SOD活性，在同居感染后第1、3、10天時，顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)低于前者，其余各時間點雖也較其低，但差異不顯著(P>0.05)。BCG與HCG相比，除同居感染后第10 天時，顯著(P<0.05)低于HCG外，其余各時間點均差異不顯著(P>0.05)。HPG番鴨腸黏膜SOD活性，在同居感染后各個時間點與HCG、BCG差異均不顯著(P>0.05)。

表5 試驗番鴨腸黏膜SOD活性的變化

Table 5 Changes of the intestinal mucosal SOD activity in experimental ducklings U·g-1

由表6可知，雛番鴨感染MDRV后，腸黏膜GSH含量先降低后急驟升高又降低波動變化，感染后期則緩慢升高，但均低于對照組，在同居感染后第1、10天時，顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)低于BCG及HPG組。與HCG組相比，CICG組腸黏膜GSH含量變化除在同居感染后第3、6天時與其差異不顯著(P>0.05)外，其余各時間點均顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)較其低。而BCG、HCG及HPG，分別在同居感染后各個時間點均差異不顯著(P>0.05)。

表6 試驗番鴨腸黏膜GSH含量的變化

Table 6 Changes of the intestinal mucosal GSH content in experimental ducklings μmol·g-1

3 討 論

腸道作為重要的營養吸收部位，又作為一個初級免疫器官，包含了機體70%～80%的淋巴組織[5]。有研究結果表明[6～9]，MDRV可導致番鴨免疫功能下降，且對其黏膜免疫有損害作用，能使其呼吸道和消化道黏膜局部的細胞免疫功能降低，人工感染番鴨呼腸孤病毒后24 h，能從腸道、肝、大腦中最先檢測到病毒抗原，說明番鴨呼腸孤病毒能導致番鴨嚴重的黏膜免疫功能損傷。

黏膜免疫功能中起中心作用的是SIgA，SIgA是黏膜免疫應答過程中的主要效應因子。SIgA被認為是參與抵御病原微生物黏附并侵入到黏膜的第一道屏障[10]。本試驗結果顯示，感染番鴨呼腸孤病毒后，其腸黏膜SIgA分泌水平明顯降低，說明MDRV會導致番鴨腸黏膜免疫功能降低，而添加一定量的猴頭菇多糖能夠顯著提高腸道SIgA分泌水平，增強其腸道黏膜免疫功能，顯著減少MDRV對雛番鴨機體的損傷。

IFN-γ是Th1細胞的典型代表，可干擾病毒復制，能特異性殺傷病毒感染細胞，在細胞免疫過程中起重要調節作用[11]。IL-4是Th2細胞典型代表，其可促進肥大細胞、T淋巴細胞和B淋巴細胞的增殖和分化，對SIgA的形成過程也具有重要作用[12]。本試驗結果顯示，雛番鴨同居感染MDRV的早期，其腸道組織IFN-γ的分泌量便開始出現顯著下降，同居感染后第6天時，達到最低值，此后開始逐漸升高，但仍低于對照組；且其腸道組織IL-4分泌水平低于對照組，在同居感染后第10天時，達到最低值，呈現波動性變化。可見，MDRV可導致雛番鴨機體的細胞免疫和體液免疫的平衡被破壞，也阻礙了SIgA的形成和分泌，造成機體的免疫抑制，與王全溪等[13]的研究結論相一致。而猴頭菇多糖可以明顯提高感染MDRV雛番鴨腸道組織IFN-γ的分泌水平，并使其IL-4的分泌水平保持動態平衡，說明HEP對IFN-γ、IL-4均有顯著的調節作用，能提高機體抗病毒能力，減少繼發感染及多重感染發生的機會，減輕MDRV對雛番鴨腸道黏膜免疫功能的損傷，具有顯著的治療作用。

氧自由基的化學性質是很活躍的，能夠攻擊細胞膜上的脂肪酸產生過氧化物；過多的活性氧自由基會導致機體正常細胞和組織的損壞。MDA可引起黏膜損傷和激活補體系統，使巨噬細胞釋放大量炎癥介質[14]，能反映機體脂質過氧化的程度，間接地反映出細胞損傷的程度。SOD是生物體內重要的抗氧化酶，可清除超氧陰離子自由基，發揮抗炎作用，反映機體清除氧自由基能力。GSH作為一個有效的自由基清除劑與SOD有協同作用，在抗氧化防御中起重要作用。本試驗結果顯示，雛番鴨感染MDRV后，其腸黏膜的MDA含量顯著升高，SOD活性及GSH含量顯著降低。有研究顯示，脂質過氧化水平越高，淋巴細胞DNA損傷率越高，進而抑制機體免疫功能[15]，提示MDRV可能使腸道受到過量氧自由基的攻擊，引起腸道損傷及腸黏膜通透性升高，導致腸道功能異常及繼發或混合感染，引起免疫抑制，但其作用機制需作進一步研究。添加HEP可顯著降低雛番鴨腸黏膜MDA含量，提高其SOD活性和GSH含量，說明HEP能夠顯著提高腸道抗氧化能力，減弱脂質過氧化作用，有效減輕MDRV對雛番鴨腸道黏膜的損傷。Z.H.Han等[16]研究結果反映了HEP可以顯著減少實驗動物的脂質過氧化水平和增加抗氧化物酶活性，本試驗驗證了這一結論。

4 結 論

猴頭菇多糖能較顯著(P<0.05)地調節雛番鴨腸道黏膜免疫，提高抗氧化能力，降低脂質過氧化水平，對感染MDRV雛番鴨腸道免疫功能及抗氧化功能具有較好的保護作用。但猴頭菇多糖對MDRV感染番鴨腸道黏膜免疫及抗氧化能力的具體調節途徑及機制有待深入研究。

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(編輯 白永平)

Effects ofHericiumerinaceusPolysaccharide on Intestinal Mucosal Immune and Antioxidant Capacity of Muscovy Ducks Infected with Reovirus

HUANG Li-na1，2，JIANG Hui-hui1，2，WANG Jie1，GAO Ting1，ZHANG Ye-fei1， WU Bao-cheng1，2，WU Yi-jian1，2*，HUANG Yi-fan1，2*

(1.CollegeofAnimalScience，FujianAgricultureandForestryUniversity，Fuzhou350002，China； 2.UniversityKeyLabforIntegratedChineseTraditionalandWesternVeterinaryMedicineandAnimalHealthcareinFujianProvince，Fuzhou350002，China)

The aim of this study was to reveal the effect ofHericiumerinaceuspolysaccharide(HEP) on the intestinal mucosal immune and antioxidant capacity of ducklings which were infected with muscovy duck reovirus(MDRV).Through the establishment of simulation model which was similar with MDRV natural infection，200 of 1-day-old healthy ducklings were randomly divided into blank control group，HEP control group，cohabitation infected control group and HEP prevention group.The samples from ducklings in each experimental group were collected and determined in the first day，the third day，the sixth day，the tenth day，the fifteenth day and the twenty-first day after cohabitation infection.The results showed that，HEP could promote the secretion of SIgA，IFN-γ and IL-4 on intestinal of infected MDRV ducklings in different degree，also with the maintenance of intestinal mucosal immune balanced effect，and increased SOD activity and GSH content，decreased the content of MDA significantly，it turned out to have the function of improving antioxidase activity，removing free radicals and inhibiting lipid peroxidation.These results indicated that HEP had certain effect on regulating intestinal mucosal immunity of the ducklings and also improving the ability of anti-oxidation，reducing the intestinal barrier function which was damaged by MDRV effectively.

muscovy duck reovirus；Hericiumerinaceuspolysaccharide；mucosal immunity；antioxidation

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.09.025

2014-12-24

國家自然科學基金項目(31372474)；福建省自然科學基金項目(2012J01067)

黃麗娜(1990-)，女，福建南安人，碩士生，主要從事中獸藥藥理學研究，E-mail：hln0990@163.com

*通信作者：吳異健，副教授，E-mail：nldwyj@163.com；黃一帆，教授，E-mail：zjhyfang@163.com

S859.7

A

0366-6964(2015)09-1671-07