5-Azadc 和TSA對雞Nanog基因啟動活性及ESC多能性維持的影響

張亞妮，王穎潔，左其生，李 東，張 蕾，湯貝貝，連 超，畢瑜林，張文慧，李碧春

(揚州大學動物科學與技術學院 江蘇省動物遺傳繁育與分子設計重點實驗室，揚州 225009)

5-Azadc 和TSA對雞Nanog基因啟動活性及ESC多能性維持的影響

張亞妮，王穎潔，左其生，李 東，張 蕾，湯貝貝，連 超，畢瑜林，張文慧，李碧春*

(揚州大學動物科學與技術學院 江蘇省動物遺傳繁育與分子設計重點實驗室，揚州 225009)

旨在克隆如皋黃雞Nanog基因啟動子，并構建含有雙熒光素酶報告基因的表達載體進行啟動子活性分析，找出該基因啟動子的核心調控區；探索甲基化抑制劑5-Azadc (5-Aza-2′-deoxycytidine)或曲古抑菌素 (Trichostatin A，TSA)對Nanog基因啟動活性及其ESC體外培養條件下多能性維持的影響，為初步闡明Nanog基因的表達調控機制提供理論依據。PCR擴增Nanog基因不同長度片段的啟動子序列，定向克隆至pGL3-basic載體和pEGFP-N1構建重組載體；將重組載體轉染DF-1細胞后，48 h收集蛋白，采用雙熒光素酶報告基因檢測系統測定其轉錄活性，確定基本轉錄調控區；將重組載體轉染DF-1細胞后添加5-Azadc或TSA對Nanog基因進行誘導表達，并通過雙熒光素酶報告基因檢測系統，分析其對Nanog基因啟動子活性的影響。選取生長至第3代的ESC，培養基中添加最適濃度的 5-Azadc和TSA，每隔兩天觀察細胞，分析其對ESC體外多能性維持的影響，并對誘導至第10天的細胞進行間接免疫熒光檢測。結果表明，成功構建3個片段的雙熒光素酶報告基因表達載體；雙熒光素酶活性檢測結果顯示，pGL3/1967活性最強；分別添加或者聯合添加5-Azadc和TSA均可使Nanog基因的轉錄活性增強；5-Azadc和TSA誘導對ESC體外培養條件下多能性維持的影響結果顯示，誘導6 d 后，對照組細胞大量分化，細胞克隆無法維持，而5-Azadc和TSA誘導組克隆明顯，5-Azadc+TSA聯合誘導組細胞克隆數量顯著多于對照組；誘導至第10天，對照組細胞完全分化，沒有細胞克隆，而誘導組存在大量細胞克隆，聯合誘導組克隆數量顯著多于其他兩組；SSEA-1間接免疫熒光結果顯示，對照組沒有明顯的ESC克隆，而5-Azadc組和聯合誘導組細胞克隆明顯，綜上表明，5-Azadc和TSA可有效地通過提高Nanog基因的表達而維持雞ESC在體外培養過程中的多能性。

Nanog基因；啟動子；5-Azadc；TSA；雙熒光素酶活性檢測系統

Nanog蛋白是含有同源盒結構域的轉錄因子[1]，由305個氨基酸組成，其中C端有強的轉錄激活結構域而N端有弱的轉錄激活結構域，在維持ESC的多能性過程中起著關鍵性調控作用[2]。

過表達Nanog的ESC在沒有LIF的培養條件下經長時間培養后，仍具有很強的自我復制能力，而且體外誘導試驗均證明這些ESC具有多能性[3-4]。Nanog過表達時ESC可在無飼養層的條件下分裂并保持多能性[5-6]；I.Chambers等[4]將成年小鼠神經細胞與高表達Nanog的ESC混合培養后發現，成年小鼠神經細胞也表現出ESC的特征。J.Zhang 等[7]用Nanog基因轉染小鼠成纖維細胞后發現，Nanog的表達使高度分化的成纖維細胞重新進入S期；J.Yu等[8]利用逆轉錄病毒介導的Nanog基因轉染人成纖維細胞后發現，人成纖維細胞逆轉為多能細胞；J.Silva等[9]發現Nanog基因在成體細胞重獲多能性的過程中起著關鍵的作用；在骨骼和成纖維細胞等已分化的成體組織中沒有檢測到Nanog基因的表達[10]； T.Nishii等[11]研究表明，CIBZ(a BTB domain zinc finger transcriptional factor)依賴Nanog基因的表達來維持ESC的多能性；A.H.Hart等[12]研究表明，Nanog基因在ESC中高表達，而在ESC分化過程中其表達水平下調；由此推測，Nanog基因的表達激活有利于維持ESC的多能性，而其表達抑制則導致ESC分化發生。在分化的細胞中Nanog表達受到限制，說明在分化細胞中有抑制Nanog基因表達的信號途徑，因此在維持干細胞多能性的過程中如何解除這種抑制作用是提高維持干細胞多能性的有效措施之一。目前人們對雞Nanog基因的結構與功能的關系及其調控基因的作用方式尚屬空白，研究雞Nanog基因的表達調節機制，對于闡明禽類胚胎干細胞多能性維持和分化的分子機理具有重要意義。本研究擬克隆如皋黃雞Nanog基因啟動子5′側翼區不同長度片段的啟動子序列，插入到pGL3-Basic構建重組載體，瞬時轉染DF-1細胞，利用雙熒光素酶報告基因系統尋找Nanog基因核心啟動子區，檢測Nanog基因啟動子活性的變化，尋找Nanog基因的核心啟動子區，并初步探索5-Azadc和TSA對Nanog基因啟動活性的影響，以期在體外培養條件下提高Nanog基因的表達量，維持雞ESC在體外培養過程中的多能性，以幫助人們更好地對雞ESC進行體外遺傳修飾和定向誘導分化研究，為生產抗病轉基因雞和具有特殊治療功能的蛋白質提供技術支持，并為ESC在再生醫學、細胞工程和藥物研制等領域的應用提供相關基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和試劑

如皋黃雞來自中國農業科學院家禽研究所。大腸桿菌DH5α感受態、膠回收試劑盒及小提質粒試劑盒均購自北京天根公司，DL 5000 DNA Marker Prime、STAR?Max DNA Polymerase、T4 DNA連接酶及限制性內切酶均購自大連寶生物公司，表達載體pGL3.0-Basic、pRL-SV40 及雙熒光素酶檢測試劑盒 Dual-Luciferase?Reporter Assay System 均購自Promega 公司，LipofectamineTM2000 購自 Invitrogen公司，5-Azadc和TSA購自SIGMA公司，雞胚胎成纖維細胞系(DF-1)購自ATCC。其余試劑均為進口或國產分析純。引物合成及測序由上海英濰捷基公司完成。

1.2 試驗方法1.2.1 生物信息學分析 利用在線軟件TFsearch(http：//www.cbrc.jp/research/db/Tfsearch.html)和AliBaba 2.1(http：//www.gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html)對Nanog基因啟動子區及其潛在的轉錄因子結合位點進行預測和分析。利用軟件(http：//www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer_results.cgi)對Nanog基因的甲基化位點進行預測。

1.2.2 基因組DNA的提取 酚氯仿法(參考《分子克隆試驗指南》(第2版))提取成年如皋黃雞基因組DNA。測定260 nm/280 nm的OD比值及DNA濃度，-20 ℃保存、備用。

1.2.3 如皋黃雞Nanog基因啟動子區不同片段的擴增 根據GenBank 上原雞Nanog基因序列(GeneID：NC_006088))翻譯起始位點(ATG)上游3 000 bp 區域的序列特征分析結果，在上下游引物的5′端分別引入XhoⅠ和KpnⅠ酶切位點和相應的保護堿基，設計不同片段長度的上游引物及共同下游引物。引物序列見表1。

表1Nanog基因啟動子不同長度片段引物序列

Table 1 The sequence of primers for constructing the vector ofNanoggene

引物名稱Name片段長度/bpFragment上游引物序列(5′→3′)Forwardprimer下游引物序列(5′→3′)ReverseprimerpGL3?30493049(-3049～+1)CGGGGTACCAAGGGGGCTTAACGTAACACATGGGpGL3?19671967(-1967～+1)CGGGGTACCCCAGCAGTACAAGCTCCGAAGCpGL3?988988(-988～+1)CGGGGTACCACAAGTGAGATGAGAAAATCAAAAGCCGCTCGAGGTCCGCA?CCTAACAGAGCCGTA

以雞基因組DNA為模板，通過PrimeSTAR?Max DNA Polymerase進行PCR擴增不同長度片段，經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后進行膠回收，將純化、加A后的PCR產物與pMDTM-19T Vector連接，并轉化至感受態細胞DH5α中，經雙酶切鑒定及測序正確后，構建正確的TA克隆載體。

1.2.4Nanog基因啟動子不同片段重組載體的構建 用KpnⅠ和XhoⅠ分別雙酶切克隆載體和pGL3.0-basic載體，酶切片段回收純化后，連接。轉化后，經雙酶切鑒定及測序正確后，分別命名pGL3/3049、pGL3/1967、pGL3/988。

1.2.5Nanog基因啟動子定性分析 將細胞接種于12孔板，細胞濃度約5×105孔-1，待細胞完全貼壁生長至80%左右時，參照LipofectamineTM2000使用說明書，將重組質粒pEGFP-N1/3049轉染至DF-1細胞中，同時設置陽性對照組(pEGFP-N1轉染細胞)和陰性對照組(pEGFP-N1-CMV-轉染細胞)，轉染24 h 后于熒光倒置顯微鏡下觀察熒光表達情況。

1.2.6 細胞瞬時轉染及其5-Azadc 和TSA誘導對Nanog基因啟動子活性的影響 轉染前，將細胞接種于24孔板，細胞數2.5×105孔-1，待細胞完全貼壁生長至80%左右時，參照LipofectamineTM2000使用說明書，分別將重組質粒和內參質粒pRL-SV40以35∶1的比例共轉染至DF-1細胞中，同時設置陰性對照組(pGL3-basic質粒與pRL-SV40質粒共轉染)，轉染48 h后收集細胞，進行雙熒光素酶活性檢測。每組3次重復。

轉染后12 h 換液時，添加不同濃度的5-Azadc 和TSA對轉染重組質粒的DF-1細胞進行誘導，36 h后進行雙熒光素酶活性檢測，找到最適宜的誘導濃度。然后以最適濃度設立5-Azadc 和TSA單獨誘導組或聯合添加誘導組，通過檢測雙熒光素酶活性檢測二者的誘導效果。

1.2.7 雙熒光素酶活性檢測 將收集后的細胞用70 μL的PBS重懸后，加入到96孔酶標板中，參照Dual-Luciferase?Reporter Assay System試劑盒說明書步驟，檢測雙熒光素酶活性。啟動子活性值為熒光素酶相對活性值(Relative luciferase activity)即螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值。采用“平均值±標準差”的形式表示。

1.2.8 5-Azadc 和TSA誘導對ESC體外培養條件下多能性的影響 為了驗證5-Azadc 和TSA對ESC體外多能性的影響，選擇第3代生長良好的ESC接種到24孔板中，接種密度為105孔-1，培養基中添加最適濃度的5-Azadc 和TSA進行誘導。接種后每隔2 d在熒光倒置顯微鏡下觀察細胞，并對誘導至第10 天 的細胞進行SSEA-1間接免疫熒光檢測。

推薦理由:憲法上的基本權利，是有效力的法規范。建構基于憲法文本的解釋方案，厘清基本權利條款的規范結構和規范內涵，使之在技術層面上成為可以適用的規范，是憲法學的基本任務?！痘緳嗬囊幏督嫞ㄔ鲇啺妫肥腔緳嗬傉擃I域的體系性著作，圍繞基本權利的功能，基本權利的國家義務，基本權利的保護范圍、限制、競合、沖突等問題進行了教義學建構，并回應了中國法治實踐中的眾多基本權利問題。

2 結 果

2.1 雞Nanog基因啟動子區生物信息學分析和甲基化水平檢測

對Nanog啟動子區域進行轉錄因子結合區域預測后發現，在Nanog基因啟動子的-3 049 ～-1 967 bp存在GCNF、Tcf3和P53等轉錄因子結合位點，而在-1 967 ～-988 bp存在p300和SP1/SP3等調控元件。甲基化預測結果顯示，在-1 387～-1 285 bp 和-157 ～+56 bp分別存在101 和103 bp的CpG島。

2.2 雞Nanog基因啟動子區不同長度片段的PCR擴增

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果表明，所獲得的不同長度片段的PCR產物大小分別與預期設計的長度相一致(圖1)，表明成功獲得了目的DNA片段。

M.DNA相對分子質量標準；1～3. PCR擴增產物M.1 kb DNA marker;1-3. PCR products圖1 Nanog基因不同長度片段啟動子的PCR擴增Fig.1 PCR products of different length promoters

2.3 雞Nanog基因啟動子不同長度片段載體的構建

用KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切3個不同長度片段載體，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖2)，分別獲得相應啟動子片段和載體片段兩條清晰的條帶，大小與預期結果相符合，且測序結果經對比后也一致，說明載體構建正確，可用于后續試驗。

M.DNA相對分子質量標準；1、3、5.pGL3/3049、pGL3/1967和pGL3/988重組質粒雙酶切；2、4、6.pGL3/3049、pGL3/1967和pGL3/988重組質粒單酶切M.DL5 000 DNA marker；1，3，5.Double restriction enzyme digestion products of pGL3/3049，pGL3/1967 and pGL3/988；2，4，6.Single restriction enzyme digestion products of pGL3/3049，pGL3/1967 and pGL3/988圖2 pGL3/3049、pGL3/1967和pGL3/988重組載體的酶切鑒定Fig.2 Identification of pGL3/3049，pGL3/1967 and pGL3/988 by restriction enzyme digestion

2.4 雞Nanog基因啟動子活性的定性分析

為檢測片段-3 049～+1 bp 是否具有啟動子活性，將pEGFP-N1/3049、pEGFP-N1、pEGFP-N1-CMV-轉染DF-1細胞。結果表明，pEGFP-N1/3049轉染的DF-1細胞表達GFP(圖3A)，但其熒光強度較強啟動子CMV驅動的陽性對照質粒pEGFP-N1弱(圖3B)，而缺失CMV的陰性對照質粒pLinker-EGFP-在細胞中未檢測到GFP的表達(圖3C)。 因此，-3 049～+1 bp片段具有啟動子活性。

圖3 雞Nanog基因啟動子-3 049～+1 bp片段的活性檢測 40×Fig.3 The promoter activity detection of chicken Nanog -3 049-+1 bp 40×

用構建的3個重組載體和pRL-SV40載體分別共轉染DF-1細胞，pGL3-Basic質粒作為陰性對照，檢測各自啟動子活性(圖4)。結果表明：與pGL3-Basic相比較，雞Nanog基因啟動子系列缺失片段都表現出一定的活性，重組質粒pGL3/1967的啟動子活性最強，說明Nanog基因啟動子的-1 967～-998 bp和-3 049 ～-1 967 bp具有重要的調控元件。

圖4 Nanog基因啟動子不同長度片段在DF-1細胞中的活性Fig.4 Activity of different promoters of Nanog gene DF-1 cells

2.6 5-Azadc和TSA誘導對Nanog基因啟動子活性的影響

由圖4可知，pGL3/1967的活性最高，因此選-1 967～+1 bp進行誘導活性檢測。DF-1細胞經pGL3/1967轉染后，采用不同濃度梯度(終濃度分別為1、5、10和15 μmol·L-1)的5-Azadc對其進行誘導，通過檢測雙熒光素酶活性確定最佳誘導濃度。不同濃度的誘導結果顯示：與對照組相比，終濃度為10 μmol·L-1的5-Azadc的誘導效率最高(圖5A)。Nanog基因啟動子區的甲基化檢測結果顯示，用5-Azadc處理后明顯降低了Nanog基因的甲基化水平。分別設置4個不同濃度梯度(0.1、0.5、1.0和1.5 μmol·L-1)的TSA進行誘導，終濃度為1.0和1.5 μmol·L-1時可極顯著提高其啟動活性(圖5B)。因此，選擇TSA的最佳誘導濃度為1.0 μmol·L-1。

用pGL3/1967轉染DF-1細胞后，培養基中分別單獨添加或者聯合添加終濃度為10 μmol·L-15-Azadc、1.0 μmol·L-1TSA對其進行誘導。結果顯示，聯合添加5-Azadc和TSA后使-1 967～+1 bp片段的轉錄活性顯著高于單獨添加組(圖5 C)。

2.7 5-Azadc和TSA誘導激活Nanog基因維持ESC體外培養多能性的影響

取培養第3代純化后的ESC細胞進行5-Azadc和TSA的誘導試驗，結果顯示，誘導6 d后，對照組細胞大量分化，細胞克隆無法維持，而5-Azadc和TSA誘導組克隆明顯，5-Azadc+TSA聯合誘導組細胞克隆數量顯著多于對照組；誘導至第10 天，對照組細胞完全分化，沒有細胞克隆，而誘導組存在大量細胞克隆，聯合誘導組克隆數量顯著多于其他3組(圖6A和B)。

取誘導至10 d 的細胞進行SSEA-1間接免疫熒光試驗，結果顯示，對照組沒有明顯的ESC克隆，而5-Azadc組和聯合組細胞克隆明顯(圖7)。實時熒光定量檢測結果發現對照組Nanog基因表達量隨著誘導天數延長持續下降，而試驗組Nanog基因維持相對穩定的水平，進一步表明，5-Azadc和TSA可有效地維持雞ESC在體外培養過程中的多能性。

A.5-Azadc最佳誘導濃度的篩選；B.TSA最佳誘導濃度的篩選;C.5-Azadc和TSA聯合誘導效果檢測A.The optimal induction concentration screening of 5-Azadc; B.The optimal induction concentration screening of 5-Azadc; C.The combination induction effect of 5-Azadc and TSA on Nanog gene promoter圖5 5-Azadc 和 TSA誘導對Nanog基因啟動活性的影響Fig.5 Effects of 5-Azadc and TSA induction on Nanog promoter activity

A.不同誘導組ESC細胞克隆40×；B和C.第6和第10天不同誘導組ESC的克隆數量A.ESC cell clone of different induction group 40×;B and C.The number comparation of different group at the 6th and 10th induction圖6 5-Azadc和TSA誘導對ESC體外分化的影響Fig.6 The effect of 5-Azadc and TSA induction on the differentiation of ESC in vitro

圖7 SSEA-1間接免疫熒光(A 40×)和Nanog定量檢測(B)Fig.7 Immunofluorescence staining of SSEA-1(A 40×) and real time quantitative detection of Nanog(B)

3 討 論

本實驗室一直致力于雞ESC向雄性生殖細胞分化的研究，由于ESC是原代細胞，在長時間的體外培養過程中會發生老化和自發分化，致使其喪失多能性，嚴重影響體外遺傳修飾和定向誘導分化的效率。因此，如何在體外培養條件下使雞ESC較長時期處于未分化狀態和維持多能性就顯得尤為重要。盡管許多研究表明添加LIF或BMP4 等細胞因子能夠維持ESC細胞的多能性[13-14]，但需將ESC生長于飼養層細胞上或在培養基中添加細胞因子、生長因子、激素、胎牛血清或血清抽提物等。最新的研究結果表明，利用一些特定的小分子化合物和無任何生長因子的基礎培養基就能很好地維持ESC的不分化狀態和多能性，尤其是目前已從化學分子庫中篩選出一些小分子化合物，并且成功地應用于ESC多能性維持的研究中，這些小分子化合物的應用簡化了試驗步驟、無需制備飼養層細胞，且避免了動物源性污染，使得培養體系的組分具體化，對延長ESC在體外培養條件下多能性的維持具有重要的意義。

DNA甲基化(DNA methylation)是發現較早的一種重要的DNA表觀遺傳修飾方式。具體指的是在DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferase，DMT)的催化作用下，生物體內甲基被選擇性地添加到DNA序列的CG兩個核苷酸的胞嘧啶上，形成5-甲基胞嘧啶的過程。甲基化發生會導致核小體之間發生緊密結合從而使基因的表達受到抑制。但是，通過添加小分子化合物使基因發生去甲基化可使基因再次表達。5-Azadc就是一種臨床普遍應用且效果極佳甲基化抑制劑，大量研究表明，對于因發生甲基化而造成表達沉默的基因，采用5-Azadc進行處理后，基因能夠重新得到表達[15-16]。為了研究DNA甲基化對雞Nanog基因啟動子活性及表達的影響，本研究對Nanog基因啟動子區的甲基化進行預測，發現在-1 662～-1 764 bp和-2 892～-2 993 bp分別存在103和102 bp的CpG島，因此采用5-Azadc處理轉染pGL3/1967雙熒光素酶報告基因載體的DF-1細胞，檢測Nanog啟動子的活性變化以分析DNA甲基化程度對啟動子活性及表達的影響；與對照組相比較，經5-Azadc處理后pGL3/1967的轉錄活性提高8倍，進一步推測采用5-Azadc處理后抑制了Nanog基因啟動子區的甲基化，從而促使其啟動活性增強。由于Nanog基因的表達活性增強，有利于維持ESC的多能性，促使大量的ESC克隆出現。

組蛋白乙?；且粋€可逆的反應，包含組蛋白乙酰轉移酶(Histone acetyltransferase，HAT)和組蛋白去乙?；?Histone deacetylase，HDAC)，二者相互進行反應。組蛋白的乙?；欣贒NA與組蛋白八聚體的解離，核小體結構松弛，從而使各種轉錄因子和協同轉錄因子能與DNA結合位點特異性結合，激活基因的轉錄。組蛋白的去乙?；沟闷渑c帶負電荷的DNA緊密結合，染色質致密卷曲，基因的轉錄受到抑制。曲古抑菌素(Trichostin A，TSA)能夠與HDAC結合，抑制組蛋白去乙?；?，促進基因表達[17-18]。R.Cotterman 等[19]研究證實，可以通過改變基因富集區域和已知基因遠距離區域的組蛋白乙酰化來調節整個基因組的染色質結構。本試驗中，為進一步驗證Nanog基因的表達是否存在組蛋白修飾，采用組蛋白去乙酰化酶抑制劑TSA來誘導Nanog啟動活性。分別探索了4個不同濃度梯度的TSA對Nanog基因啟動活性的影響，發現終濃度為1.0和1.5 μmoloL-1時均可極顯著提高Nanog啟動活性，表明Nanog基因存在組蛋白修飾作用。即通過TSA處理后，抑制了組蛋白的去乙?；?，促進Nanog基因的轉錄，使其在ESC的表達量增多，促使較多數目的ESC克隆出現，延長ESC體外培養的多能性。

綜上表明，本研究成功構建了pEGFP-N1/3049，對Nanog啟動子活性進行定性驗證，證明其具有啟動活性；通過構建包含3個不同長度Nanog基因啟動子片段的熒光素酶報告載體，分別轉染了DF-1細胞，說明Nanog基因啟動子的-1 967～-998 bp具有正調控元件，而在-3 049～-1 967 bp具有負調控元件。根據對Nanog基因啟動子區的甲基化分析結果，發現添加5-Azadc后能明顯促進Nanog基因的啟動活性，進一步表明該基因的啟動受到甲基化水平的調控，這與CEF細胞和ESC細胞Nanog基因的甲基化檢測水平相一致，提示分化的細胞中Nanog低表達可能是由于甲基化修飾造成的。TSA的聯合添加進一步提高了Nanog基因的啟動活性，說明Nanog基因的表達亦受到乙?；降恼{控，提示在后續的研究中，如果要在體外通過提高Nanog基因的表達量而延長ESC細胞的多能性維持時間可通過添加誘導劑5-Azadc和TSA來實現。此外，本研究通過啟動子預測軟件Promoter Scan和TFSEARCH database預測分析后發現：在Nanog基因啟動子的-3 049～-1 967 bp存在GCNF、Tcf3和P53等轉錄因子結合位點，雙熒光素酶活性檢測結果顯示，缺失該段導致Nanog的轉錄活性提高，因此，下一步將定點缺失該結合位點，進一步驗證Nanog的啟動子活性，進而闡明雞Nanog基因轉錄調控機制，為有效地提高Nanog的表達水平提供參考依據。

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(編輯 程金華)

Effects of 5-Azadc and TSA Induction on Promoter Activity ofNanogand Pluripotency Maintaining in Chicken

ZHANG Ya-ni，WANG Ying-jie，ZUO Qi-sheng，LI Dong，ZHANG Lei，TANG Bei-bei，LIAN Chao，BI Yu-lin，ZHANG Wen-hui，LI Bi-chun*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology，YangzhouUniversity，KeyLaboratoryofAnimalBreedingReproductionandMolecularDesignforJiangsuProvince，Yangzhou225009，China)

The aim of this study was to cloneNanoggene promoter of chicken and construct the expression vector containing dual luciferase report gene to analyze the promoter activity，find out its core regulatory region，explore the effect of 5-Azadc(5-Aza-2′-deoxycytidine) and TSA(Trichostatin A)on its promoter activity and ESC pluripotent maintaininginvitrocondition，so as to elucidate preliminarily the regulating mechanisms ofNanoggene and provide the theory basis for the future research.The different length fragmentsNanoggene promoter was amplified by PCR technology and cloned into pGL3-basic vector or pEGFP-N1 directly to construct a recombinant vector.After the recombinant vector was transfected into DF-1 cells for 24 h and the protein was collected，the transcriptional activity ofNanoggene was measured by dual luciferase assay system to search for the basic transcriptional regulatory region；The recombinant vector was transfected into DF-1 cells，and methylation inhibitor 5-Azadc or histone deacetylase inhibitor TSA was added to detect its effect on the promoter activity.The third generation ESC was selected and grown into the medium supplemented with the optimum concentration of 5-Azadc and TSA，the cells were observed every 2 d to analyze the pluripotent maintaining of ESCinvitroculture condition，and indirect immune fluorescence of SSEA-1 was detected on the tenth days induction.The results showed that 3 dual luciferase report gene expression vector was constructed successfully.The strongest dual luciferase activity was shown by pGL3/1967；the transcription activity ofNanoggene was enhanced when 5-Azadc and TSA was added single or together.ESC was cultured in the medium with 5-Azadc and TSAinvitro，a great number of cells differentiated after 6 d of induction and cell colony was not maintained in control group，while the cell colony in 5-Azadc and TSA induction group was significant higher than the control group；On the tenth days induction，the cells in control group were fully differentiated，there were still a large number of cell clone in the 5-Azadc + TSA group，the number of colony were significantly more than the other 3 groups；the results of indirect immunofluorescence showed there was no cell colony in the control group，but more colonies were observed in the 5-Azadc and TSA induction group.It further showed that 5-Azadc and TSA could effectively maintain ESC pluripotence of chickeninvitroculture condition by increasing the expression ofNanoggene.

Nanog；promoter；5-Azadc；TSA；dual luciferase activity system

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.12.008

2015-02-11

國家自然科學基金(31301959；31272429；31472087)；高等學校博士學科點專項科研基金(20123250120009)；中國博士后基金((2012M511326))；江蘇高校優勢學科建設工程資助項目

張亞妮(1977-)，女，陜西渭南人，副教授，博士，主要從事動物胚胎工程與遺傳工程研究，E-mail：ynzhang@yzu.edu.cn

*通信作者：李碧春，教授，博士，主要從事動物胚胎工程與遺傳工程研究，E-mail：yubcli@yzu.edu.cn

S831.2

A

0366-6964(2015)12-2176-09