不同水平乳鐵蛋白對滇撒配套系仔豬生產性能、小腸形態學和機體抗病能力的影響

安清聰，徐娜娜，張春勇，潘洪彬，李美荃，陳克嶙，郭榮富

(云南農業大學動物科學技術學院，云南省動物營養與飼料重點實驗室，昆明 650201)

不同水平乳鐵蛋白對滇撒配套系仔豬生產性能、小腸形態學和機體抗病能力的影響

安清聰#，徐娜娜#，張春勇，潘洪彬，李美荃，陳克嶙，郭榮富*

(云南農業大學動物科學技術學院，云南省動物營養與飼料重點實驗室，昆明 650201)

本試驗旨在研究不同水平乳鐵蛋白(LF)對滇撒配套系斷奶仔豬生產性能、腸道保護和機體抗病能力的影響。選用日齡為(28±2)d，平均體重為(6.56±0.75)kg的健康滇撒配套系斷奶仔豬240頭，隨機分為5個處理，每個處理48頭，6個重復，每個重復8頭豬，分別飼喂基礎飼糧(對照組)，基礎飼糧+125 mg·kg-1乳鐵蛋白，基礎飼糧+250 mg·kg-1乳鐵蛋白，基礎飼糧+500 mg·kg-1乳鐵蛋白和抗生素組(50 mg·kg-1土霉素)，試驗期42 d。試驗結束時，每個處理中每個重復隨機選4頭，每個處理共24頭仔豬，經前腔靜脈采血，分離血清，檢測血清免疫球蛋白G( IgG )、一氧化氮(NO)含量，乳酸脫氫酶(LDH)、一氧化氮合酶(NOS)和溶菌酶(LSZ)活性及總鐵結合力(TIBC)。每個處理中每個重復屠宰1頭仔豬，共6頭，收集心、肝、脾以檢測鐵調素(Hepcidin)、β防御素1(pBD-1)、β防御素2(pBD-2)和β防御素3(pBD-3)基因mRNA相對表達量。結果表明：1)250 mg·kg-1乳鐵蛋白組斷奶仔豬的末重、日增重、日采食量顯著高于對照組和抗生素組(P<0.05)，料重比和腹瀉率則顯著低于對照組和抗生素組(P<0.05)；2) 250 mg·kg-1組的IgG和NO顯著高于對照組(P<0.05)，TIBC極顯著高于抗生素組和對照組(P<0.01)；250 mg·kg-1乳鐵蛋白組十二指腸V/C，空腸絨毛長度、V/C，回腸絨毛長度、V/C極顯著高于抗生素組和對照組(P<0.01)，250 mg·kg-1乳鐵蛋白組回腸隱窩深度極顯著低于對照組(P<0.01)；腹瀉率、IgG、NO、LSZ、十二指腸隱窩深度、十二指腸絨毛長度/隱窩深度、空腸絨毛長度、空腸隱窩深度和空腸絨毛長度/隱窩深度隨乳鐵蛋白添加水平呈二次曲線變化(P<0.05)；3)250 mg·kg-1乳鐵蛋白組極顯著高于對照組和抗生素組斷奶仔豬心、肝中的HepcidinmRNA的表達量(P<0.01)，125 mg·kg-1乳鐵蛋白組顯著高于對照組和抗生素組斷奶仔豬肝中HepcidinmRNA的表達量(P<0.05)，肝HepcidinmRNA表達量極顯著的高于心和脾(P<0.01)；250 mg·kg-1乳鐵蛋白組心、脾的pBD-1 mRNA的表達量極顯著高于其他組(P<0.01)；肝的pBD-2 mRNA表達量顯著或極顯著的高于心或脾(P<0.05，P<0.01)；添加量為250 mg·kg-1時，心和脾的pBD-3 mRNA的表達量極顯著高于其他組(P<0.01)。結果提示，飼糧中添加乳鐵蛋白可明顯改善滇撒配套系仔豬的生產性能；改善血清免疫學參數和小腸形態學；能夠通過誘導滇撒配套系仔豬的心、肝和脾Hepcidin和pBD-1，pBD-2，pBD-3基因表達上調方式增強仔豬抗病能力；在本試驗條件下，綜合生產性能、血清免疫學和小腸形態學參數二次曲線結果，滇撒配套系仔豬日糧中乳鐵蛋白的適宜添加量為250～300 mg·kg-1。

滇撒配套系仔豬；乳鐵蛋白；免疫學參數；小腸形態學；鐵調素；β防御素

仔豬斷奶后，無論是心理還是機體都會產生強烈應激，免疫力下降，最終影響養豬生產效益。近年來，應用抗生素改善仔豬健康和生產性能所引起的抗生素耐藥性和動物體內的藥物殘留已引起了人們的高度重視。研發和應用具有安全綠色特點的抗生素替代品，不僅能夠提高動物免疫力，而且可以避免抗生素引起的弊端。乳鐵蛋白是一種多功能糖蛋白，具有防止微生物感染，調節免疫力，促進細胞生長等作用[1]。王燕等在日糧中添加0.125%和0.25%的乳鐵蛋白能顯著或極顯著提高杜長大斷奶仔豬抗菌肽PMAP-37基因的表達[2]。Y.Wang等發現，仔豬日糧中添加乳鐵蛋白可以極顯著提高內源性抗微生物多肽PR-39基因的表達[3]。先天免疫和適應性免疫是宿主防御的兩個基本要素。先天免疫機制之一是廣譜抗菌性的分泌物質，如cathelicidins和小陽離子多肽，命名為defensins，其中β-defensin構成一組新發現的富含胱氨酸的抗菌肽，有3個分子內的二硫鍵，許多的β-defensin已經在哺乳動物和鳥類的上皮組織和白細胞中發現[4-5]。Hepcidin是一種具有廣譜殺菌抑菌作用的抗菌肽，具有25個氨基酸，主要在肝細胞合成[6]，在體內和其他抗菌肽一樣參與宿主的先天防御。目前國內外關于乳鐵蛋白對斷奶仔豬的生長性能和腸道健康雖有研究，但是關于乳鐵蛋白對滇撒豬配套系仔豬生產性能和抗病能力的研究鮮見報道。滇撒豬是云南省地方優良品種資源，形成歷史悠久，品種特征突出，具有抗病力強、耐粗飼、繁殖率高、肉質好等特點，已被列入國家級畜禽資源保護名錄。

本試驗旨在探究不同水平乳鐵蛋白對滇撒配套系仔豬生長性能，血清免疫學參數，心、肝、脾組織Hepcidin與β-defensinmRNA表達量的影響，旨在為乳鐵蛋白作為早期斷奶仔豬抗生素替代品的研究和應用提供思路和科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

選用日齡為(28±2)d，平均體重為(6.56±0.75)kg的健康滇撒配套系斷奶仔豬240頭，試驗隨機分為5個處理，每個處理48頭，6個重復，每個重復8頭，斷奶后分別飼喂基礎飼糧(對照組)，基礎飼糧+125 mg·kg-1乳鐵蛋白，基礎飼糧+250 mg·kg-1乳鐵蛋白，基礎飼糧+500 mg·kg-1乳鐵蛋白和抗生素陽性組(50 mg·kg-1土霉素)，試驗期為42 d。

1.2 飼糧配制和飼養管理

參照NRC(2012)豬營養需要推薦量配制基礎飼糧。LF來源：進口LF(DMV international Co.)，以乳牛初乳為原料，利用超濾法從牛乳中分離純化乳鐵蛋白。乳鐵蛋白參數：純度為95%。其乳鐵蛋白水平的添加量分別為125、250和500 mg·kg-1。基礎飼糧組成和營養水平見表1。

表1 基礎飼糧及營養水平(風干基礎)

Table1 Composition and nutrient levels of basal diets(air-dry basis) %

1).預混料為每千克飼糧提供：VA 18 000 IU，VD33 400 IU，VE 32 mg，VK 4 mg，生物素0.32 mg，葉酸1.6 mg，VC 304 mg，膽堿0.5 mg，Cu 7 mg，Fe 102 mg，Zn 103.5 mg，Mn 6.36 mg，I 0.144 mg，Co 0.32 mg，Se 0.32 mg。2).DE為計算值，其余均為實測值

1).The premix provided the following per kg of diets：VA 18 000 IU，VD33 400 IU，VE 32 mg，VK 4 mg，biotin 0.32 mg，folic acid 1.6 mg，VC 304 mg，choline 0.5 mg，Cu 7 mg，Fe 102 mg，Zn 103.5 mg，Mn 6.36 mg，I 0.144 mg，Co 0.32 mg，Se 0.32 mg.2).DE was a calculated value and others were measured values

1.3 測定指標與方法

1.3.1 生長性能的測定 試驗結束時，對試驗仔豬空腹稱重，計算仔豬的平均日增重、平均日采食量、料重比和腹瀉率。

1.3.2 血清免疫參數的測定 試驗結束時，仔豬空腹稱重，每個處理中每個重復隨機取4頭，每個處理共24頭仔豬，經前腔靜脈采血10 mL，制備血清備用。測定免疫球蛋白G、NO含量、乳酸脫氫酶(LDH)、一氧化氮合酶、溶菌酶(LZM)活性和總鐵結合力(TIBC)。免疫球蛋白G含量采用免疫濁度法測定，一氧化氮含量、一氧化氮合酶活性、LDH活性和TIBC。采用比色法測定，LZM活性使用試管比濁法，試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供，參照說明書進行測定。

1.3.3 小腸形態學的觀察 仔豬屠宰后，在十二指腸、空腸和回腸中段剪取約1 cm組織樣，然后將樣品按照常規組織切片要求進行處理，制作完成后，然后在100倍光鏡下用測微尺測量20根最長絨毛的高度和相應的隱窩深度，參照陳恒燦等[7]的方法進行處理和觀察小腸形態學變化。1.3.4 仔豬組織Hepcidin、pBD-1、pBD-2、pBD-3 mRNA相對表達量檢測 每個處理中每個重復屠宰1頭仔豬，每個處理共6頭，迅速采集心、肝、脾3種組織，-80 ℃速凍，用于檢測Hepcidin、pBD-1、pBD-2、pBD-3 mRNA的相對表達量。

1.3.5 實時熒光定量PCR 本試驗Real-Time qPCR采用Eva GreenⅠ染料法，反應在Bio-Rad CFX96TMReal-Time PCR Systems上進行。按照預先篩選好的qRT-PCR反應條件和體系將上述標準品進行擴增。qRT-PCR反應體系為20 μL：SsoFastTMEvaGreen?Supermix 10 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，cDNA模板2 μL，加滅菌去離子水至20 μL。

基因引物設計采用Primer Express Software(PE Applied Biosystems，CA)。各引物序列見表2。

表2 實時熒光定量PCR引物

Table 2 Primers for real-time PCR

目的基因Targetgene引物序列(5′?3′)Primersequence產物大小/bpProductsize退火溫度/℃Annealingtemperature肌動蛋白β?actinF：TCTGGCACCACACCTTCTR：TGATCTGGGTCATCTTCTCAC11457鐵調素HepcidinF：TCCGTTCTCCCATCCCAGACR：GCAGCACATCCCACAGATTG17154豬β?防御素1pBD?1F：ACCGCCTCCTCCTTGTATR：GGTGCCGATCTGTTTCAT14654豬β?防御素2pBD?2F：CCTGCTTACGGGTCTTGR：TCTGCTGTGGCTTCTGG16659豬β?防御素3pBD?3F：GAAGTCTACAGAAGCCAAATR：GGTAACAAATAGCACCATAA10255

1.4 數據處理與分析

所有組織的Hepcidin、pBD-1、pBD-2、pBD-3 mRNA表達量均是以β-actin為內參基因，最終設pBD-3在肝中對照組的相對表達量為1，相對熒光定量計算方法采用M.W.Pfaffl[8]的方法計算。所有數據均采用Excel進行整理，采用SPSS 17.0統計軟件進行統計處理，單因子方差分析檢驗組間顯著性，然后進行鄧肯氏多重比較，結果用“平均數±標準差”表示。對生產性能、血液參數、小腸形態學參數與日糧中乳鐵蛋白的添加量進行二次回歸分析。

2 結 果

2.1 乳鐵蛋白對滇撒配套系仔豬生產性能的影響

乳鐵蛋白對滇撒配套系仔豬生產性能影響的試驗結果見表3。由表3可見，抗生素組和乳鐵蛋白組仔豬末重高于對照組，其中250 mg·kg-1組的末重最高，顯著高于其他組(P<0.05)；日增重250 mg·kg-1組的顯著高于其他組(P<0.05)；乳鐵蛋白組的日采食量均高于抗生素組和對照組，其中250 mg·kg-1組的最高；250 mg·kg-1組的料重比顯著低于其他組(P<0.05)；250 mg·kg-1組的腹瀉率最低，差異顯著(P<0.05) 。

2.2 乳鐵蛋白對滇撒配套系仔豬血清免疫參數和生化指標的影響

由表4可以看出，乳鐵蛋白組的斷奶仔豬血清中IgG含量、NO含量、LZM活性和TIBC均高于對照組，其中乳鐵蛋白組的LZM活性和TIBC均極顯著高于對照組(P<0.01)，250和500 mg·kg-1組血清中IgG含量顯著高于對照組(P<0.05)，其中250 mg·kg-1組的IgG 含量最高，而125和250 mg·kg-1組的NO含量均極顯著高于對照組(P<0.01)。乳鐵蛋白組、對照組與抗生素組的血清LDH無顯著差異(P>0.05)，其中125與500 mg·kg-1乳鐵蛋白組都高于對照組，而250 mg·kg-1乳鐵蛋白組和抗生素組的血清LDH都低于對照組。乳鐵蛋白組、對照組和抗生素組之間的NOS均無顯著性差異(P>0.05)。

表3 乳鐵蛋白對滇撒配套系仔豬生產性能的影響

Table 3 Effects of LF on growth performance of Diansa weaning piglets

項目Item對照組Controlgroup乳鐵蛋白添加水平/(mg·kg-1)LFsupplementallevel土霉素/(mg·kg-1)Terramycin12525050050初重/kgInitialweight6．43±0．75a6．45±0．80a6．82±0．69a6．64±0．66a6．48±0．89a末重/kgFinalweight19．65±1．11c19．98±0．97bc22．42±0．95a20．83±1．19b20．47±0．92b日增重/(g·d-1)ADG314．76±17．18c322．14±14．28bc371．42±21．26a337．85±22．14b330．10±19．85b日采食量/(g·d-1)ADFI569．72±26．41c576．63±25．32bc623．98±19．26a591．24±27．15ab574．37±13．14b料重比G∶F1．81±0．06c1．79±0．02bc1．68±0．03a1．75±0．02b1．74±0．04b腹瀉率/%Diarrhearate8．02±0．97a5．41±1．02b3．65±0．61c5．18±0．64b5．18±0．64b

同行數據不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下表同

In the same raw，values with different small letters mean significant difference(P<0.05)，and with different capital letters mean extremely significant difference(P<0.01).The same as below

表4 乳鐵蛋白對滇撒配套系仔豬血清免疫參數和血清生化指標的影響

Table 4 Effects of LF on serum immunological parameters and biochemical indice of Diansa weaning piglets

項目Item對照組Controlgroup乳鐵蛋白添加水平/(mg·kg-1)LFsupplementallevel土霉素/(mg·kg-1)Terramycin12525050050免疫球蛋白G/(g·L-1)IgG13．51±0．49Ab13．69±0．17Aab14．17±0．19Aa14．01±0．21Aa13．97±0．26Aab溶菌酶/(U·mL-1)LZM386．67±16．26Bb592．00±10．95Aa620．00±26．51Aa600．00±20．91Aa665．00±27．25Aa乳酸脫氫酶/(U·L-1)LDH8151．29±70．33Aa8156．83±67．20Aa8096．12±62．09Aa8289．97±80．51Aa8117．16±89．56Aa一氧化氮/(μmol·L-1)NO33．50±2．59Cc47．05±2．55Aa46．20±3．00ABa40．00±1．00BCb44．09±1．13ABab一氧化氮合酶/(U·mL-1)NOS36．95±2．58Aa35．18±1．60Aa36．38±2．47Aa34．97±3．36Aa37．09±2．49Aa總鐵結合力/(μmol·L-1)TIBC100．66±0．58Cc115．67±3．21Bb124．59±1．56Aa126．57±1．40Aa99．50±1．29Cc

2.3 乳鐵蛋白對滇撒配套系仔豬小腸形態學的影響

由表5可知，十二指腸的絨毛長度250 mg·kg-1組最高，而隱窩深度250 mg·kg-1組的最低，且絨毛長度/隱窩深度極顯著高于其他組(P<0.01)；空腸的絨毛長度250 mg·kg-1組極顯著高于其他組(P<0.01)，各組之間的隱窩深度無顯著性差異，且250 mg·kg-1組最低，絨毛長度/隱窩深度250 mg·kg-1組極顯著高于其他組(P<0.01)；回腸的絨毛長度250和500 mg·kg-1組極顯著高于其他組(P<0.01)，隱窩深度250 mg·kg-1組最低，絨毛長度/隱窩深度250 mg·kg-1組極顯著高于其他組(P<0.01)。

表5 乳鐵蛋白對滇撒配套系仔豬小腸形態學的影響

Table 5 Effects of LF on small intestinal morphology of Diansa weaning piglets

項目Item對照組Controlgroup乳鐵蛋白添加水平/(mg·kg-1)LFsupplementallevel土霉素/(mg·kg-1)Terramycin12525050050十二指腸Duodenum絨毛長度/μmVillusheight223．33±26．03230．33±24．13253．00±22．06227．00±28．21235．60±23．81隱窩深度/μmCryptdepth118．33±13．65109．33±18．72102．25±16．34107．25±11．27106．20±12．40絨毛長度/隱窩深度V/C1．89±0．14Cc2．09±0．16BbC2．47±0．10Aa2．11±0．09BbC2．22±0．07Bb空腸Jejunum絨毛長度/μmVillusheight172．67±2．31Cd202．80±6．22Bb230．00±2．00Aa180．67±4．62Cd192．67±5．03Bc隱窩深度/μmCryptdepth138．67±14．05133．00±10．89127．33±10．07145．55±6．25127．33±3．06絨毛長度/隱窩深度V/C1．21±0．03Cd1．54±0．02Bb1．85±0．05Aa1．27±0．03Cc1．49±0．02Bb回腸Ileum絨毛長度/μmVillusheight185．33±10．07Bb184．00±17．78Bb223．33±7．57Aa208．80±5．76Aa180．00±4．32Bb隱窩深度/μmCryptdepth122．67±11．02Aa120．50±7．00ABab104．67±4．16Bc108．80±4．82ABbc112．00±8．7ABabc絨毛長度/隱窩深度V/C1．49±0．02Cd1．51±0．03Cd2．16±0．05Aa1．87±0．07Bb1．59±0．01Cc

2.4 乳鐵蛋白對滇撒配套系仔豬生產性能、血清免疫參數、小腸形態學的二次方程與求解結果

由表6可知，斷奶仔豬腹瀉率、血清中免疫球蛋白G、一氧化氮含量，LZM活性、TIBC、十二指腸隱窩深度、十二指腸絨毛長度/隱窩深度、空腸絨毛長度、空腸隱窩深度和空腸絨毛長度/隱窩深度隨LF添加水平的提高呈二次曲線變化(P<0.05)。

2.5 乳鐵蛋白對滇撒配套系仔豬組織HepcidinmRNA表達量的影響

乳鐵蛋白對滇撒配套系仔豬心、肝和脾的HepcidinmRNA 表達的影響結果見圖1。在心中，添加量為250 mg·kg-1時表達量最高，差異極顯著(P<0.01)，125和500 mg·kg-1組表達量極顯著低于對照組(P<0.01)。在肝中，3個添加水平的表達量均極顯著高于對照組和抗生素組(P<0.01)，隨乳鐵蛋白添加量的增加，Hepcidin表達呈上升趨勢，當添加量為250 mg·kg-1時，Hepcidin表達量最高，差異極顯著(P<0.01)，隨后降低。在脾中，隨乳鐵蛋白添加量的增加，Hepcidin表達呈上升趨勢，當添加量為125 mg·kg-1時，Hepcidin的表達量最高，差異極顯著(P<0.01)，隨后降低，抗生素組高于對照組，差異不顯著(P>0.05)。

抗生素組心組織的表達量極顯著低于對照組(P<0.01)，而在肝和脾中無顯著性差異(P>0.05)。所有組的肝組織的表達量極顯著的高于心和脾(P<0.01)，而心組織的表達量與脾均無顯著性差異(P>0.05)。

表6 乳鐵蛋白水平與仔豬生產性能、血清免疫學參數和小腸形態學的二次方程與求解結果

Table 6 Quadratice equations and results of LF on growth performance，serum immunological parameters and small intestinal morphology of piglets

項目Item二次方程Quadraticequation乳鐵蛋白/(mg·kg-1)LF腹瀉率Diarrhearatey=0．00004x2-0．0283x+8．0841(R2=0．9950，r=0．9975)353．75免疫球蛋白IgGy=-0．000005x2+0．0037x+13．455(R2=0．8622，r=0．9285)370．00溶菌酶LSZy=-0．0024x2+1．5726x+399．11(R2=0．9473，r=0．9732)327．63一氧化氮NOy=-0．0002x2+0．0999x+34．555(R2=0．8856，r=0．9411)249．75十二指腸隱窩深度Duodenumcryptdepthy=0．0002x2-0．1026x+118．7(R2=0．9879，r=0．9939)256．50十二指腸絨毛長度/隱窩深度DuodenumV/Cy=-0．000006x2±0．0037x+1．8447(R2=0．8567，r=0．9256)308．33空腸絨毛長度Jejunumvillusheighty=-0．0008x2±0．415x+170．08(R2=0．9586，r=0．9790)259．38空腸隱窩深度Jejunumcryptdepthy=0．0002x2-0．0959x+139．48(R2=0．9565，r=0．9780)239．75空腸絨毛長度/隱窩深度JejunumV/Cy=-0．00001x2±0．0073x+0．83(R2=0．9999，r=0．9999)365．00

不同小、大寫字母表示同一組織不同處理的差異顯著或極顯著 (P<0.05， P<0.01)。**.表示同一處理組織間差異極顯著(P<0.01)；*.表示同一處理組織間差異顯著(P<0.05)。下圖同The different upper and lower case letters indicate significant differences or highly significant difference between different groups in the same tissue(P<0.01，P<0.05).**.Indicate extremely significant difference between different tissues in the same group(P<0.01)；*.Indicate significant difference between different tissues in the same group(P<0.05).The same as below圖1 滇撒配套系仔豬組織中Hepcidin基因表達趨勢Fig.1 Expression trend of Hepcidin in Diansa weaning piglets

2.6 乳鐵蛋白對滇撒配套系仔豬組織pBD-1、pBD-2、pBD-3 mRNA表達量的影響

2.6.1 乳鐵蛋白對滇撒配套系仔豬組織pBD-1mRNA表達量的影響 由圖2可以看出，在心中，添加量為250 mg·kg-1時pBD-1的表達量最高，差異極顯著(P<0.01)，抗生素組的表達量最低。在肝中，3個乳鐵蛋白組均極顯著地高于對照組與抗生素組(P<0.01)，當添加量為500 mg·kg-1時，pBD-1的表達量最高，抗生素組的表達量最低，與對照組無顯著性差異(P>0.05)。在脾中，添加量為250 mg·kg-1時，pBD-1的表達量最高，差異極顯著(P<0.01)。

組織之間，心的表達量最高，其中抗生素組和250 mg·kg-1組心組織的表達量極顯著的高于肝和脾(P<0.01)，其余的組均差異顯著(P<0.05)，脾的表達量高于肝。

圖2 滇撒配套系仔豬組織中pBD-1基因表達趨勢Fig.2 Expression trend of pBD-1 in Diansa weaning piglets

2.6.2 乳鐵蛋白對滇撒配套系仔豬組織pBD-2mRNA表達量的影響 由圖3可以看出，在心中，隨著乳鐵蛋白的添加，pBD-2的表達量呈上升趨勢，當添加量為125 mg·kg-1時pBD-2的表達量最高，隨后降低，500 mg·kg-1組的表達量最低。在肝中，隨著乳鐵蛋白的添加，pBD-2的表達量呈上升趨勢，當添加量為125 mg·kg-1時，pBD-2的表達量最高，3個添加量的表達量均高于對照組，其中當添加量為125和250 mg·kg-1時極顯著高于對照組(P<0.01)。在脾中，添加量為250 mg·kg-1時的表達量最高，差異極顯著(P<0.01)，抗生素組的表達量最低，差異極顯著(P<0.01)。

組織之間，除了對照組和抗生素組中肝組織的表達量顯著高于心和脾外(P<0.05)，其余的均極顯著高于心和脾(P<0.01)。抗生素組的心組織的表達量顯著高于脾(P<0.05)，其余的組中二者均無顯著性差異(P>0.05)。

2.6.3 乳鐵蛋白對滇撒配套系仔豬組織pBD-3 mRNA表達量的影響 由圖4可以看出，在心中，隨著乳鐵蛋白的添加，PBD-3的表達量呈上升趨勢，添加量為250 mg·kg-1時，pBD-3的表達量最高。肝組織中，乳鐵蛋白組均極顯著高于對照組(P<0.01)。在脾中，抗生素組的表達量最低，與對照組差異不顯著(P>0.05)。

組織之間，500 mg·kg-1組中，脾組織pBD-3的表達量分別顯著或極顯著高于心和肝(P<0.05，P<0.01)，而心的表達量極顯著高于肝組織(P<0.01)。除了500 mg·kg-1組外，均是心組織的表達量極顯著高于肝和脾(P<0.01)，且肝和脾無顯著性差異(P>0.05)。

圖3 滇撒配套系仔豬組織中pBD-2基因表達趨勢Fig.3 Expression trend of pBD-2 in Diansa weaning piglets

圖4 滇撒配套系仔豬組織中pBD-3基因表達趨勢Fig.4 Expression trend of pBD-3 in Diansa weaning piglets

3 討 論

3.1 乳鐵蛋白對滇撒配套系仔豬生產性能的影響

Y.Wang等發現，日糧中添加乳鐵蛋白能夠改善斷奶仔豬的日增重和料重比[3]；張凱等發現添加乳鐵蛋白能夠降低斷奶仔豬的腹瀉率[9]。Z.Tang等在早期斷奶仔豬日糧中添加牛乳鐵蛋白衍生肽lactoferampin與lactoferricin，日增重比對照組提高21%，且能夠促進仔豬腹瀉恢復[10]。本試驗中，添加250和500 mg·kg-1的乳鐵蛋白能夠提高仔豬的日增重，并且能夠降低這兩個組的腹瀉率，這與以上研究結果基本一致。

3.2 乳鐵蛋白對滇撒配套系仔豬血清免疫參數的影響

IgG是機體內重要的免疫球蛋白之一，參與體液免疫反應。X.S.Tang等在仔豬日糧中添加乳鐵蛋白的重組多肽能夠提高仔豬體內的IgG含量[11]，本試驗中250和500 mg·kg-1組的IgG含量顯著高于對照組，這與上述研究結果一致，抗生素組與3個乳鐵蛋白組均無顯著差異，說明乳鐵蛋白可改善斷奶仔豬的免疫力。溶菌酶具有溶菌的作用，是體內吞噬細胞活化的指示因子，本試驗中乳鐵蛋白組極顯著的高于對照組，結果提示，乳鐵蛋白可提高機體的免疫能力。據報道，日糧中添加乳鐵蛋白能夠提高亞洲鯰魚的溶菌酶的活力[12]。本試驗中，抗生素組的溶菌酶活力雖然高于3個乳鐵蛋白組，但差異不顯著，這提示，乳鐵蛋白在提高血清溶菌酶活力方面具有類似抗生素的效果。LDH在國際上是用來評價細胞整體損傷的檢測指標，它存在于各個組織器官中，由于細胞損傷時發生腸溶作用將其釋放，存在于細胞外。本試驗中幾個組之間的LDH無顯著性差異，結果顯示，乳鐵蛋白的添加并沒有影響斷奶仔豬的正常細胞功能。NO是L-Arg在一氧化氮合酶的作用下合成的內皮細胞衍生舒張因子[13]，NO參與調節機體的特異性體液免疫反應。本試驗中，3個乳鐵蛋白組NO極顯著或顯著的高于對照組，本結果提示，乳鐵蛋白可提高機體的免疫力，效果可能優于抗生素的效果。NOS有3種類型，包括神經型(nNOS)、誘導型(iNOS)和內皮型(eNOS)，其中iNOS催化生成的NO較多，且時間長，在正常情況下，iNOS基因并不表達，但在受到炎癥因子和細菌毒素誘導下則高度表達[14-16]。本試驗結果表明，NOS無顯著性差異，可能是由于乳鐵蛋白未誘導iNOS表達。TIBC表明測定血清中的轉鐵蛋白結合鐵的最大能力，間接反映血清轉鐵蛋白的含量。在日糧中添加不同水平乳鐵蛋白均能夠提高亞洲鯰魚的總鐵結合力，其中800 mg·kg-1的添加水平顯著高于對照組[12]。本試驗中，乳鐵蛋白組TIBC極顯著高于對照組和抗生素組，這與以上結果基本一致。

3.3 乳鐵蛋白對滇撒配套系仔豬小腸形態學的影響

腸道是豬最重要的消化器官，豬消化道內環境在促進養分吸收及防止飼料或環境中的病原菌侵入等方面具有重要作用。仔豬小腸絨毛長度和隱窩深度的改變反映小腸形態學及其功能的重要變化。大量試驗證明，乳鐵蛋白能增加小腸絨毛高度，降低隱窩深度。Y.Wang等發現，在斷奶仔豬的日糧中添加乳鐵蛋白能夠顯著提高小腸中段的絨毛長度和顯著降低其隱窩深度(15.30%，9.60%，P<0.05)[3]；A.Blais等發現，添加乳鐵蛋白能夠提高小鼠的空腸絨毛長度[17]。本試驗中，250 mg·kg-1乳鐵蛋白組能夠提高十二指腸、空腸、回腸的絨毛長度，并且降低隱窩深度，提高了絨毛長度與隱窩深度的比值。這與以上研究是一致的。

3.4 乳鐵蛋白對滇撒配套系仔豬組織Hepcidin基因表達的影響

2000年分別從人的血漿和尿液分離獲得Hepcidin。Hepcidin是一種主要在肝高效特異表達的富含半胱氨酸的新型抗菌肽，屬抗菌肽中防御素(Defensin)蛋白家族，與許多富含半胱氨酸的抗菌肽類似，Hepcidin 同樣具有抗多種真菌和細菌等活性。

T.Ganz研究表明，Hepcidin主要在肝中合成，這與本試驗結果中肝的表達量極顯著高于心與脾是一致的[18]。Hepcidin受血清和肝中鐵的濃度和紅血球生成中對鐵的需求調控，G.Nicolas等發現Hepcidin抑制小腸對鐵的吸收和促進鐵在網狀內皮細胞的滯留，當鐵超過需求時，Hepcidin被誘導表達升高進而抑制鐵的吸收[19]，后來又發現Hepcidin組成性表達能抑制鐵的超負荷[20]。在本試驗中，乳鐵蛋白的添加提高了肝和脾中Hepcidin的表達，說明乳鐵蛋白作為鐵源誘導了抗菌肽Hepcidin的表達。本試驗中，250 mg·kg-1乳鐵蛋白組斷奶仔豬的血清中IgG和溶菌酶均較高，說明在適宜水平的乳鐵蛋白的調節下，斷奶仔豬的免疫力得到了提高，在肝中250 mg·kg-1組的表達水平最高，這與血清免疫參數的趨勢是一致的。

3.5 乳鐵蛋白對滇撒配套系仔豬β-defensin基因表達的影響

Defensin家族的抗菌肽廣泛分布在許多哺乳動物、昆蟲和植物體內。Defensins可進一步分為組成型和誘導型，組成型的防御素在炎癥和感染期間的表達量保持不變，而誘導型在炎癥或者感染期間表達量會增加[21]，pBD-1、pBD-3屬于組成型[22]，而pBD-2是誘導型[23]。pBD-1廣泛地分布在豬組織中，特別是舌黏膜[24]。pBD-1基因在炎癥和感染期間是被組成性的表達，不受誘導，盡管其與很多誘導性上皮β-defensins的氨基酸序列、基因組結構、表達和位點相似[25]。本試驗中，在心和脾中250 mg·kg-1乳鐵蛋白組的pBD-1表達量極顯著高于其他組，在肝中乳鐵蛋白組的表達量均極顯著的高于對照組和抗生素組，表明乳鐵蛋白的添加促進了pBD-1基因的表達，而在心、肝和脾中不同的表達趨勢可能與pBD-1組成型表達有關。信號途徑誘導β-防御素2的表達，其中AP-1和NF-кB的作用較為突出，該基因的轉錄起始點近端的2個NF-кB位點是轉錄表達所必需的[26]。在肝中，3個乳鐵蛋白組的表達量均高于或顯著高于對照組，說明乳鐵蛋白的添加能夠誘導肝中pBD-2基因的表達，心中125 mg·kg-1添加水平組和脾中250 mg·kg-1添加水平組均表達最高，心和脾中的表達量可能并不直接受乳鐵蛋白的誘導。這種表達趨勢可能是由于乳鐵蛋白中的某種成分活化了NF-кB因子，NF-кB因子作為多個基因的起始近端的調控子能夠控制基因的表達，從而誘導pBD-2基因的表達。本試驗中，除500 mg·kg-1組外，pBD-3均是心的表達量高于肝和脾。3個添加水平均能極顯著提高肝和脾中pBD-3基因的表達，說明乳鐵蛋白的添加誘導了肝和脾中pBD-3基因的表達，而在心中250 mg·kg-1添加水平極顯著高于對照組的表達量，誘導了基因的表達。

4 結 論

4.1 在飼糧中添加適宜水平乳鐵蛋白可明顯改善滇撒配套系仔豬生產性能，顯著降低仔豬腹瀉率。綜合生產性能、血液參數和小腸形態學二次曲線結果，在本試驗條件下乳鐵蛋白的適宜添加量為250～300 mg·kg-1。

4.2 飼糧中添加乳鐵蛋白可提高血清中IgG、NO含量，LZM活性和 TIBC，在一定程度上改善LDH活性；乳鐵蛋白能夠改善仔豬小腸黏膜形態和生物功能。

4.3 飼糧中添加乳鐵蛋白誘導了滇撒配套系仔豬的心、肝和脾中Hepcidin和pBD-1、pBD-2、pBD-3基因的表達，從而改善其抗病能力。

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(編輯 郭云雁)

The Effect of Different Levels of Lactoferrin on the Growth Performance，Small Intestinal Morphology and Body Resistance to Disease of Diansa Weaning Piglets

AN Qing-cong#，XU Na-na#，ZHANG Chun-yong，PAN Hong-bin，LI Mei-quan，CHEN Ke-lin，GUO Rong-fu*

(KeyLaboratoryofAnimalNutritionandFeedofYunnanProvince，CollegeofAnimalScienceandTechnology，YunnanAgriculturalUniversity，Kunming650201，China)

This experiment was conducted to investigate the effects of different levels of lactoferrin(LF) on growth performance，intestinal protection and the body resistance to disease of Diansa weaning piglets.Two hundred and forty healthy Diansa weaning piglets，(28±2) days of age with(6.56±0.75) kg of average body weight，were allocated randomly to 5 groups，48 for each group，and each had 6 replicates with 8 piglets per replicate.They were fed with basal diet(control group)，basal diet + 125 mg·kg-1LF，basal diet + 250 mg·kg-1LF，basal diet + 500 mg·kg-1LF and antibiotics positive group(50 mg·kg-1terramycin)，respectively.The trial period lasted 42 d.At the end，24 piglets，with 4 piglets in each replicate per each group，were selected，and the test piglets were collected blood from precava，then serum were separated.The IgG and NO content，LDH，NOS and LSZ activity and TIBC of serum were detected.Six piglets，1 piglet in each replicate per each group，were slaughtered.The heart，liver and spleen were collected to detect Hepcidin and β defense 1(pBD-1)，β defense 2(pBD-2) and β defense 3(pBD-3) genes mRNA expression.The results showed that：1) The final weight，ADG and ADFI of 250 mg·kg-1LF group were significantly higher than those of control group and terramycin group(P<0.05)，feed conversion and diarrhea rate were significantly lower than those of control group and terramycin group(P<0.05).2) IgG levels，NO content of 250 mg·kg-1LF group were significantly higher than those of control group(P<0.05)，TIBC of 250 mg·kg-1LF group were extremely significantly higher than those of control group and terramycin group(P<0.01).V/C of duodenum，villus height and V/C of jejunum，villus height and V/C of ileum in 250 mg·kg-1LF group were extremely significantly higher than those in control group and terramycin group(P<0.01)，crypt depth of ileum in 250 mg·kg-1LF group were extremely significantly lower than those in control group(P<0.01).Results showed that diarrhea rate，IgG，NO，LSZ，crypt depth of duodenum，V/C of duodenum，villus height of jejunum，crypt depth of jejunum，V/C of jejunum increased with a quadratic curve by the LF adding levels(P<0.05)；3)HepcidinmRNA expression in heart and liver of piglets in 250 mg·kg-1LF group were extremely significantly higher than those of control group and terramycin group(P<0.01).HepcidinmRNA expression in liver in 125 mg·kg-1LF group were significantly higher than those of control group and terramycin group(P<0.05).TheHepcidinmRNA expression in liver was extremely significantly higher than that in the heart and spleen(P<0.01).ThepBD-1 mRNA expression in the heart and spleen in 250 mg·kg-1LF group were extremely significantly higher than those of the other groups(P<0.01).ThepBD-2 mRNA expression in liver was significantly or extremely significant higher than those in heart and the spleen(P<0.05，P<0.01).When the adding level was 250 mg·kg-1，thepBD-3 mRNA expression in heart and spleen were extremely significantly higher than the other groups(P<0.01).Results suggest that adding LF in the diet can obviously improve the growth performance，serum immunological parameters and small intestinal morphology of Diansa weaning piglets，and enhance piglets disease resistance through inducing genes expression ofHepcidin，pBD-1，pBD-2，pBD-3 in heart，liver and spleen of Diansa weaning piglets.In this experimental conditions，based on quadratic curve results of growth performance，serum immunological and small intestinal morphology parameters，the adequate amount of LF in Diansa weaning piglets diet was 250-300 mg·kg-1.

Diansa weaning piglets；lactoferrin；immunological parameters；small intestinal morphology；Hepcidin；β defense

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.12.012

2015-02-05

云南省重大科技專項(2012ZA018)；云南省現代農業生豬產業技術體系(云財教【2013】160號)

安清聰(1968-)，女，甘肅靖遠人，博士，副教授，主要從事單胃動物營養與免疫分子基礎研究，E-mail：naccynaccy@163.com；徐娜娜(1990-)，女，山東安丘人，碩士，主要從事豬的營養與免疫研究，E-mail：738908970@qq.com。二者并列為第一作者

*通信作者：郭榮富，博士，教授，博士生導師，E-mail：rongfug@163.com

S828；S815.4

A

0366-6964(2015)12-2206-12